[發明專利]一種脂肽定量檢測的方法

有效

• 申請號: 201410020263.9
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103760268A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 牟伯中;楊世忠;劉金峰;剛洪澤;孟勇
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術領域

本發明涉及一種脂肽定量檢測的方法，具體涉及一種利用熒光標記物檢測脂肽的方法。

背景技術

脂肽是一種來源廣泛，種類繁多，結構特殊的生物表面活性劑。脂肽擁有化學表面活性劑不可比擬的優良的表界面性質，而且對環境友好；脂肽生物活性廣泛，它具有抗菌、抗腫瘤、抗凝血、溶細胞以及改變酶的活性等作用。因此，微生物脂肽在表面活性劑領域以及生物醫藥領域具有廣泛的應用前景。

由于脂肽表界面活性高，一般用量較低，應用體系中脂肽的檢測一直是一個難題。傳統的重量法是在測試溶液中加鹽酸使脂肽沉淀，沉淀物用有機溶劑反復萃取，蒸發掉有機溶劑、烘干后稱重，定量脂肽，該檢測方法的主要缺點是：體系需要加鹽酸使脂肽沉淀，有機溶劑反復萃取，步驟繁瑣，提取過程中易受到其他脂溶性物質的干擾，因而得不到脂肽的純凈物，只能粗略定量；薄層色譜法是將含脂肽樣品采用薄層色譜分離，分離出的脂肽斑點進行水解，斑點水解后進行特異性染色，通過比較染色斑點的大小和顏色深度來定量脂肽，該檢測方法的主要缺點是：薄層色譜分離后脂肽斑點需要采用濃鹽酸高溫密封水解，反應過程復雜，條件苛刻，同時，薄層色譜的分離效率低，定量誤差大；高效液相色譜法是通過高效液相色譜對含脂肽的樣品進行分離，利用紫外檢測器檢測，由保留時間確定脂肽峰，通過分析峰面積或峰高定量分析脂肽，該檢測方法的主要缺點是：對現場復雜樣品需要進行復雜的前處理，以免影響色譜柱的分離效果，同時檢出限也較高(適用于脂肽含量約幾百ppm的樣品檢測)，無法檢測痕量脂肽。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種檢測方便快捷、反應條件溫和、檢測靈敏度高的脂肽定量檢測的方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種脂肽定量檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)待檢樣品分離獲得脂肽；2)脂肽與熒光標記物反應得到熒光標記的脂肽；3)熒光標記的脂肽利用高效液相色譜檢測；4)由色譜峰面積計算脂肽含量。

步驟1)待檢樣品分離獲得脂肽是在待檢樣品中加6M鹽酸調節溶液pH＝2.0，然后乙醚萃取，萃取液除去乙醚獲得脂肽。

步驟2)所述的熒光標記物為4-溴甲基-7-甲氧基香豆素。

所述的待檢樣品中脂肽濃度在0.1ppm～1ppm、1ppm～100ppm和100ppm～600ppm時，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素的加入量分別為0.1mg、1mg和2mg。

所述的熒光標記物與脂肽反應在有機溶劑中進行，所述有機溶劑選自乙腈、丙酮或四氯化碳中的一種。

所述的有機溶劑為乙腈。

所述的熒光標記物與脂肽反應在催化劑下進行，催化劑選自Na₂CO₃、吡啶或三乙胺中的一種。

所述的催化劑為三乙胺，三乙胺加入量為100μL。

所述的熒光標記物與脂肽反應體系總體積采用所述的有機溶劑定容至1mL。

所述的熒光標記物與脂肽反應的溫度為40℃～80℃，反應時間為10min～30min。

所述的熒光標記物與脂肽反應的溫度為60℃，反應時間為20min。

本發明采用熒光標記脂肽，利用高效液相色譜分離及熒光檢測器檢測。現有技術采用高效液相色譜直接檢測發酵液樣品的脂肽(未熒光標記)，結果見圖1(紫外檢測(a)和熒光檢測(b))，可見，由于樣品中脂肽的含量太低，不能被紫外檢測器和熒光檢測器檢測到，現有技術無法檢測該樣品。本發明技術針對同一發酵液樣品，采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素熒光標記脂肽，標記后采用高效液相色譜檢測，結果見圖2(紫外檢測(a)和熒光檢測(b))，由圖2可見，使用熒光標記后，帶有熒光基團的脂肽采用熒光檢測器檢測，響應值很高；而采用紫外檢測器檢測，響應值很低，可見，本發明技術采用熒光標記脂肽后結合熒光檢測能大大降低了脂肽檢出限。同時，由于靈敏度大大提高，熒光的色譜圖還可識別脂肽分子中脂肪鏈長度分別為13個碳、14個碳和15個碳的脂肽同系物(見圖2)。

與現有技術相比，本發明采用熒光標記脂肽，利用高效液相色譜分離及熒光檢測器檢測的方法具有方法簡便快捷，反應條件溫和，檢出限低的特點，檢出限可以達到0.1ppm，大大提高了檢測靈敏度。

附圖說明

圖1現有技術直接檢測發酵液中脂肽的高效液相色譜圖(紫外檢測(a)和熒光檢測(b))：

圖2本發明技術采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素熒光標記發酵液中脂肽后檢測的高效液相色譜圖(紫外檢測(a)和熒光檢測(b))。