[發明專利]一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法

有效

• 申請號: 201410019576.2
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103760311A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 匡華;胥傳來;孔德昭;馬偉;徐麗廣;宋珊珊;劉麗強
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/02
• 分類號: G01N33/02;G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及了一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，屬于免疫分析技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）是一種常見的食源性致病菌，金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%。

在食品加工過程中，經過熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩定，100℃?30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。2011年我國公布速凍面米制品新國標GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來的不得檢出變為限量檢出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數合格而腸毒素超標的情況，腸毒素的快速檢測對于保障食品安全具有更加重要的意義。

??近年來，ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點越來越多地用于腸毒素的檢測，雖然膠體金試紙條具有操作簡單、穩定性高、不需要借助專門儀器、適合現場快速檢測的優點，但ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度，而且更適合高通量檢測，因此ELISA也具有相當廣泛的應用價值。

發明內容

(一)要解決的技術問題

本發明的目的在于提供一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用于食品中SEE的批量、快速檢測。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明建立了一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E（SEE）的雙抗體夾心法，該方法包括對檢測方法的優化。

其中，單克隆抗體是采用重組SEE經過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。

其中，用于配對的抗體是通過優化參數下夾心法配對，并通過多次試驗篩選確定的，具有穩定性好、靈敏度高的特點。

其中，建立的夾心法優化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標準品稀釋液，酶標抗體稀釋液，酶標抗體稀釋濃度。LOD達到0.04ng/mL，R²為0.992。

本發明方法的檢測分析原理是：

酶標板上包被了包被抗體1E5，即CGMCC?No.7214，合適的濃度下可以最大限度捕獲SEE；洗板3次，洗去未結合的包被抗體，加入封閉液220μL封閉板孔上多余結合位點；洗板3次，加入樣品及對照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶標抗體2E3-HRP，即CGMCC?No.7215-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入顯色液顯色15min。如果樣品中SEE濃度≥0.1ng/mL，那么祥品中SEE被包被抗體1E5捕獲并與酶標抗體2E3-HRP結合，并催化底物在450nm產生吸收值，并被判定為陽性；如果樣品中SEE濃度＜0.1ng/mL那么樣品中SEE不被包被抗體1E5捕獲或者捕獲數量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。

（1）SEE單克隆抗體的制備

????以重組表達的SEE（北京軍事醫學科學院提供）為免疫原，免疫?8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周進行首免，10μg/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，10μg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，8μg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第七周尾部采血測效價，選擇效價最高的老鼠；第八周進行沖刺免疫，4μg/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進行融合。篩選采用間接ELISA進行，共篩選到12個細胞株。

（2）單克隆抗體的配對篩選

將純化后的12株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶（HRP），直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對。配對參數如下：包被抗體5μg/mL；包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標品濃度50ng/mL，標品稀釋液0.01M、pH7.2?的PBS；酶標抗體稀釋500倍使用。在此條件下，實驗成功得到了6對P/N值>10的配對。

（3）夾心法的建立

選擇檢測限最穩定的配對，即以1E5為包被抗體，以2E3作為酶標抗體建立夾心法。具體參數如下：

抗體包被濃度：6μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液，

標品稀釋液：0.01M、pH7.2?的PBS，

檢測抗體濃度：2μg/mL，