[發(fā)明專利]一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410019576.2
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103760311A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 匡華;胥傳來;孔德昭;馬偉;徐麗廣;宋珊珊;劉麗強
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/02
• 分類號: G01N33/02;G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，金黃色葡萄球菌腸毒素E縮寫為SEE，其特征在于：酶標板上包被了包被抗體1E5：即CGMCC?No.7214，合適的濃度下最大限度捕獲SEE；洗板3次，洗去未結(jié)合的包被抗體，加入封閉液220μL封閉板孔上多余結(jié)合位點；洗板3次，加入樣品及對照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶標抗體2E3-HRP：即CGMCC?No.7215-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入顯色液顯色15min；

樣品中SEE濃度≥0.1ng/mL，樣品中SEE被包被抗體1E5捕獲并與酶標抗體2E3-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，被判定為陽性；

樣品中SEE濃度＜0.1ng/mL，樣品中SEE不被包被抗體1E5捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性；

（1）SEE單克隆抗體的制備

????以北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的重組表達的SEE為免疫原，免疫?8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細胞融合、篩選，共篩選到12個細胞株；

（2）單克隆抗體的配對篩選

將純化后的12株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對，配對參數(shù)如下：包被抗體5μg/mL；包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標品濃度50ng/mL，標品稀釋液0.01M、pH7.2?的PBS；酶標抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實驗成功得到了6對P/N值>10的配對；

（3）夾心法的建立

選擇檢測限最穩(wěn)定的配對，即以1E5為包被抗體，以2E3作為酶標抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下：

抗體包被濃度：6μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液，

標品稀釋液：0.01M、pH7.2?的PBS，

檢測抗體濃度：2μg/mL，

反應(yīng)時間：包被、封閉37℃，2h；標準品，37℃，1h；檢測抗體37℃，1h；顯色15min；

優(yōu)化后SEE夾心法，LOD：0.04ng/mL，檢測限0.1ng/mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，其特征在于：測定步驟為：

a、包被：用6μg/mL的1E5包被酶標板，100μL?/孔，4℃過夜；

b、洗滌：用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μL?/?孔，然后甩干反應(yīng)板，所述PBST為含0.05%吐溫-20的PBS；

c、封閉：含0.2%酪蛋白酸鈉的0.01M，pH9.6?CBS，200μL?/孔，37℃封閉2h；

d、洗滌：同b；

e、樣品：用樣品稀釋液0.01M，pH7.2?PBS將SEE母液稀釋成0.04，0.12，0.37，1.11，3.33，10ng/mL系列濃度，另設(shè)一個PBS空白對照，酶標板1-6列每孔加入100μL系列濃度樣品，第8列加入空白對照，于37℃孵育1h；

f、洗滌：同b；

g、加2μg/mL的酶標抗體2E3-HRP，100μL?/孔，37℃孵育1h；

h、洗滌：同b；

i、顯色：加顯色液?100μL?/孔，顯色15min；

顯色液應(yīng)在使用前，按照顯色液A:顯色液B體積比=5:1的比例配置使用；

顯色液A：0.933?g檸檬酸，3.68?g?Na₂HPO₄·12H₂O，18?μL?30%H₂O₂，100mL水；

顯色液B：60?mg四甲基聯(lián)苯胺TMB溶于100?mL乙二醇；

j、終止：加2?mol/L硫酸終止液，50μL?/孔；

k、測定：用酶標儀檢測OD₄₅₀nm，繪制SEE雙抗體夾心法的標準曲線，樣品測定時從該標準曲線上OD₄₅₀nm值對應(yīng)求得樣品中SEE含量。