[發(fā)明專利]賽庚啶半抗原、抗原及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410018901.3
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN104792989A
• 公開（公告）日: 2015-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 溫凱;王照鵬;王戰(zhàn)輝;吳小平;賈良曦;秦譽;王進(jìn);蘇麗芳;覃丹鳳;曾江龍;殷緩緩;陳銀輝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京維德維康生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及賽庚啶半抗原、抗原、單克隆抗體制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

賽庚啶（Cyproheptadine）化學(xué)名稱為1-甲基-4-（5H-二苯并[a,d?]環(huán)庚三烯-5-亞基）哌啶鹽酸鹽倍半水合物，別名塞庚定、二苯環(huán)庚啶、偏痛定，英文別名2,6-dichloro-N-(2-imidazolin-2-yl)aniline。分子式C21H21N·HCl·3/2?H2O；分子量：350.89。賽庚啶為白色或淺黃色結(jié)晶粉末，無臭、味微苦。熔點113℃。在甲醇中易溶；在氯仿中溶解，溶液有乳化現(xiàn)象（若以干燥品溶解，溶液即澄明）；在乙醇中略溶；在水中微溶，水溶液呈酸性反應(yīng)；在乙醚中幾乎不溶。賽庚啶為人用抗過敏藥，對抗體內(nèi)組胺對血管、支氣管平滑肌的作用，從而消除過敏癥狀，也可用于改善患者的食欲。賽庚啶是一個典型的H1受體阻滯劑，屬于抗組胺藥，但同時也是5-羥色胺受體拮抗劑，可在下丘腦食欲中樞拮抗5-羥色胺，這可以解釋賽庚啶具有刺激食欲的功能。賽庚啶易吸收，主要代謝物是葡萄糖醛酸苷季銨物，以及芳環(huán)羥基化、N-去甲基化和雜環(huán)氧化產(chǎn)物。賽庚啶常見的副作用為輕、中度的嗜睡、頭昏、乏力、口干等，自2005?年起已在國內(nèi)的飼料產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)添加，分析原因可能為通過促進(jìn)動物食欲以達(dá)到增重的目的。食用含有賽庚啶殘留的動物源性產(chǎn)品，對人體健康具有一定的危害性，對兒童的作用更為明顯，高濃度可直接引發(fā)昏迷、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀，嚴(yán)重者則直接導(dǎo)致兒童死亡。賽庚啶并不是一種飼料添加劑，世界衛(wèi)生組織、我國、美國、歐盟及一些發(fā)達(dá)國家等都禁止違法使用賽庚啶。2010年12月農(nóng)業(yè)部1519號公告已明確把賽庚啶列入了《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》清單。

目前國內(nèi)外大多采用高效液相色譜法測定，這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫化學(xué)分析由于在抗原抗體的定性定量方面獨特的優(yōu)勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點彌補(bǔ)了理化分析的不足。賽庚啶人工抗原的制備為這一方法的實施奠定了重要基礎(chǔ)。影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計與合成就是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分子獸藥殘留快速檢測技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種賽庚啶半抗原、抗原、特異性抗體制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的賽庚啶半抗原，其結(jié)構(gòu)為式Ⅰ所示：

本發(fā)明還保護(hù)式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：

將賽庚啶，氯碳酸乙酯和甲苯的混合物回流，冷卻后，用鹽酸和水洗滌，干燥并濃縮；用正己烷處理，得到淺黃色結(jié)晶，重結(jié)晶，得到微黃色針狀結(jié)晶；產(chǎn)物加入水和氫氧化鋰(一水),pH試紙檢測pH=10以上；室溫水解反應(yīng)后用乙酸乙酯萃取，萃取水解反應(yīng)水相一到兩次，除去雜質(zhì)，再用鹽酸調(diào)pH值到4左右，用乙酸乙酯萃取，旋干得到半抗原。

本發(fā)明所提供的賽庚啶抗原，是將賽庚啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗原。

所述賽庚啶抗原，其結(jié)構(gòu)為式Ⅱ所示：

本發(fā)明還保護(hù)所述賽庚啶抗原的制備方法，包括如下步驟：

（1）取式Ⅰ所示產(chǎn)物?31.7mg，溶于3ml二甲基甲酰胺DMF中；

（2）加入1ml0.01M?PBS助溶，加入碳二亞胺EDC38mg，N-羥基琥珀酰亞胺NHS38mg，室溫活化2h；

（3）取載體蛋白100mg溶于10ml的0.1M碳酸氫鈉溶液中，將活化物在4℃冰水浴條件下，加入到蛋白中，4℃攪拌反應(yīng)過夜，置1L0.01MPBS中透析8次，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

（4）分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲狀腺蛋白（TG）或血藍(lán)蛋白（KLH）等。

所述賽庚啶抗原可以作為免疫原制備賽庚啶特異性抗體，也可以作為包被原制備酶標(biāo)板。

所述抗體具體可為單克隆抗體。

式Ⅰ所示產(chǎn)物、所述賽庚啶抗原、所述抗體均可應(yīng)用于檢測賽庚啶。

本發(fā)明還公布了應(yīng)用賽庚啶抗原和賽庚啶單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫試劑盒。

所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有賽庚啶抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、賽庚啶系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗滌液。