[發(fā)明專利]靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410018463.0
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103768599A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王永剛;張偉杰;馬建忠;冷非凡;蒲秀瑛;陳卓;張庭瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭州理工大學(xué)
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61P35/00
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 董斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)中重組蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種重組蛋白光敏劑的制備方法。?

背景技術(shù)

我國每年腫瘤發(fā)病率超過260萬，平均每2.5min就有一個人死于腫瘤,因次腫瘤成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種高發(fā)病。光動力學(xué)治療是現(xiàn)代無償治療的最新進(jìn)展，以安全、有效、毒副作用小和成本相對較低而收到臨床治療的青睞，1996年美國批準(zhǔn)光動力學(xué)治療用于臨床，中國于2003年批準(zhǔn)用于臨床。決定光動力學(xué)治療效果的關(guān)鍵因素在于光敏劑，由于腫瘤組織對光敏劑只是相對的選擇性吸收，并不具備特異性，所以正常組織中不可避免地潴留有少量的光敏劑，可能產(chǎn)生光毒副作用，因此需要開發(fā)靶向光敏劑。目前常用的靶向光敏劑通過為化學(xué)偶聯(lián)法得到，其不足之處在于產(chǎn)量低，成本高、活性低、有可能引入有機(jī)溶劑而增加毒副反應(yīng)等。?

別藻藍(lán)蛋白只有結(jié)合了色基才具有光學(xué)活性，因而可以用于腫瘤光動力學(xué)治療和診斷以及免疫學(xué)等醫(yī)學(xué)研究的別藻膽蛋白必須結(jié)合有色基。色基生成和連接到脫輔基蛋白的過程是一系列酶促反應(yīng)過程?(Tooley?et?al.,?2001;?Fairchild?&?Glazer,?2001)。此前，我們成功克隆了基因cpcE、cpcF、ho1及pcyA，構(gòu)建了載體pCDF-cpcE-cpcF,?ho1-pcyA?(V1)，最終獲得了具有光學(xué)活性的藻藍(lán)蛋白及別藻藍(lán)蛋白α亞基。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提高一種靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法。?

本發(fā)明是靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法，靶向重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6×His蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白α進(jìn)行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6×His標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)650nm光照后可以殺滅腫瘤細(xì)胞。?

靶向重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為：?

（1）設(shè)計引物EGFRi1和EGFRi2，即序列3和序列4，linker1和linker2，即序列5和序列6，以及APCα1和APCα2，即序列7和序列8；

（2）從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白α亞基基因APCα；

（3）以EGFRi1和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi－linker1核苷酸序列；

（4）以linker1和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2－APCα1核苷酸序列；

（5）以EGFRi－linker1和linker2－APCα1為模版，以EGFRi1和linker2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi－linker－APCα1核苷酸序列；

（6）以EGFRi－linker－APCα1和APCα為模版，以EGFRi1和APCα2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長597bP；

（7）將融合基因序列克隆入表達(dá)載體pCDF-cpcE-cpcF,?ho1-pcyA?載體，轉(zhuǎn)化E.?coli?BL21；

（8）培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6×His標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。

?重組蛋白光敏劑可無需引入有機(jī)溶劑、不會使蛋白變性、產(chǎn)量高、成本低，可以克服化學(xué)偶聯(lián)光敏劑的不足。本發(fā)明將EGFR的干擾序列和別藻藍(lán)蛋白融合，克隆入pCDF?-cpcE-cpcF，ho1-pcyA?(V1)載體，構(gòu)建具有靶向EGFR作用的重組蛋白光敏劑。利用EGFR的干擾序列和別藻藍(lán)蛋白構(gòu)建重組蛋白類光敏劑，改善光動力學(xué)治療的應(yīng)用效果。?

附圖說明

圖1為重組蛋白光敏劑SDS-PAGE電泳圖，圖2為重組蛋白光敏劑紫外吸收光譜，圖3為重組蛋白光敏劑的熒光發(fā)射光譜，圖4為重組蛋白光敏劑光照后殺滅宮頸癌HepG2細(xì)胞的顯微鏡圖片，圖5為靶向EGFR的重組蛋白光敏劑不同條件下殺滅HepG2細(xì)胞效果和量效關(guān)系（重組蛋白光敏劑對HepG2細(xì)胞的增殖抑制）。?

具體實(shí)施方式