[發明專利]一種紅葉石楠高效基因轉化的方法

無效

• 申請號: 201410017267.1
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103805631A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉靜;羅磊;黃艷艷;王迎;牛慶霖;張虹;趙進紅;馮殿齊
• 申請（專利權）人: 泰安市泰山林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種紅葉石楠高效基因轉化的方法，屬于植物生物技術領域。

背景技術

紅葉石楠(Photinia?xfrasery)是薔薇科石楠屬雜交種的統稱，是起源于亞熱帶的常綠灌木樹種。春季其新葉紅艷，夏季轉綠，秋、冬、春三季呈現紅色，霜重色逾濃，低溫色更佳。做行道樹，其桿立如火把；做綠籬，其狀臥如火龍；修剪造景，形狀可千姿百態，景觀效果美麗，被譽為“紅葉綠籬之王”。自上世紀九十年代引入我國以來，就被列為具有較高開發價值的彩葉樹種。但由于紅葉石楠不適應北方如山東、河北、北京等地的冬季低溫，容易造成凍害，限制了推廣和發展進程。國內研究人員對紅葉石楠抗寒性、變色機理、越冬適應性等方面開展了相關研究，以期通過馴化和抗寒適應性篩選抗寒品種，但截止目前仍未選育出有效抗寒的紅葉石楠品種。隨著分子生物學的發展，利用基因工程技術將抗凍基因轉到植物體內，培育抗寒品種成為當前木本植物抗寒育種研究的熱點。

為此，通過cDNA-AFLP的差異表達分析技術，從我國西北荒漠地區僅存的常綠的木本植物沙冬青(源于遠古第三紀的國家二級瀕危保護植物)中篩選出13個低溫誘導上調表達轉錄片段。對其中的一個EST片段已通過RACE獲得其全長cDNA，構建了植物表達載體，轉化擬南芥成功并獲得了抗凍性明顯提高的轉基因擬南芥植株，但是轉化木本植物未能成功。本發明選擇另一個抗凍基因AmGS進行克隆，并通過基因槍法與根瘤農桿菌介導法相結合的遺傳轉化方法將它導入木本植物紅葉石楠中，選育抗寒新品種。

目前的植物遺傳轉化技術可分為兩大類，一類是以基因槍轉化法為代表的直接基因轉移技術，基因槍法把遺傳物質或其他物質附著于高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器，是目前國際上最先進的基因導入技術。氣體基因槍以壓縮氣體(氦或氮)轉換成的氣體沖擊波為動力，使氣體基因槍產生一種“冷”的氣體沖擊波進入轟擊室，因此可免遭由“熱”氣體沖擊波引起的細胞損傷。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩定的和高效率的轉化作用。氣體基因槍有一個產生沖擊波的特殊結構，在恰當的氣壓范圍內從3.5MPa-10MPa，具有相應不同的可破裂膜，將包覆DNA的粒子穿越，射入在轟擊室底部的靶細胞中(最大靶直徑50mm)。基因槍適用于動植物、細胞培養物、胚胎、細菌及小型動物的轉基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。另一類是生物介導的轉化方法，主要有農桿菌介導和病毒介導兩種轉化方法，其中農桿菌介導的轉化方法是目前應用最廣的基因轉化方法，具有操作簡便、成本低、轉化率高的特點，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化。本發明將兩種遺傳轉化技術有機的結合起來，用于紅葉石楠抗寒基因轉化。

發明內容

本發明的目的在于提供一種紅葉石楠高效基因轉化的方法，以便針對紅葉石楠抗寒基因進行轉化。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。

一種紅葉石楠高效基因轉化的方法，具體采用的是基因槍法和農桿菌介導法結合的基因轉化方法，其步驟包括：(1)質粒DNA的提取；(2)受體材料的準備；(3)鎢粉預處理；(4)微彈制備；(5)基因槍轟擊；(6)受體材料的預培養；(7)農桿菌侵染；(8)共培養；(9)抑菌及卡那霉素篩選培養；(10)轉化植株PCR和Southern?Blotting檢測。

各步驟具體如下：