[發明專利]一種紅葉石楠高效基因轉化的方法

無效

• 申請號: 201410017267.1
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103805631A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉靜;羅磊;黃艷艷;王迎;牛慶霖;張虹;趙進紅;馮殿齊
• 申請（專利權）人: 泰安市泰山林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種紅葉石楠高效基因轉化的方法，其特征在于：具體采用的是基因槍法和農桿菌介導法結合的基因轉化方法，其步驟包括：(1)質粒DNA的提取；(2)受體材料的準備；(3)鎢粉預處理；(4)微彈制備；(5)基因槍轟擊；(6)受體材料的預培養；(7)農桿菌侵染；(8)共培養；(9)抑菌及卡那霉素篩選培養；(10)轉化植株PCR和Southern?Blotting檢測；

上述各步驟具體如下：

所述步驟(1)質粒DNA的提取：所用含有目的基因的農桿菌菌株LBA4404是含有35S啟動子、目的基因、終止子NOS和標記基因NPTII的雙元載體pCAMBIA2300—35S—OCS，在超凈工作臺上挑取保存的菌體接種YEP固體培養基的培養，菌板置于恒溫培養箱，28℃培養2～3d，至單菌落產生；挑取單菌落接種YEP液體培養基的培養，在恒溫搖床上28℃、200～210r／min過夜培養(24h左右至對數生長后期)，待OD600值為0.5～0.8時可用于質粒DNA的提取；從在含20mg／l?Kanamycin和15mg／lGentamycin5—8ml的液體YEP培養基中接Agrobacterium細胞，然后在28℃、200—220rpm培養24h；然后進行質粒提取；新鮮配制SolII溶液(880μl?H20，100μlSDS10％，20μl10N?NaOH)，及包含4mg／ml溶菌酶Lysozyme的200μl?SolI(P1)溶液；對培養一晝夜的的Falcon試管在3600rpm速度下進行離心12min，丟棄上清；用200μl5M?NaCl重懸農桿菌細胞，利用渦旋將農桿菌細胞混勻，轉移到Eppendorf管中；加入20μl10％N—Lauroylsarcosine?sodium溶液，上下倒置6—8次混勻(從不同方向倒置)；最大速度(13000rpm)下離心2min，丟掉上清液；用200μl含4mg／ml?Lysozyme的Sol?I(P1)(Sol?I：50mM?glucose，25mM?Tris—Cl(8.0)，10M?EDTA(8.0))重懸沉淀，渦旋直至混勻，置于冰上，加入400μl?Sol?II(P2)(Sol?II：880μlH2O，100μl?SDS10％，20μl10N?NaOH)，上下倒置6-8次混勻(從不同方向倒置)，在冰上放置5min，加入300μl?Sol?III(P3)，用手振蕩；在冰上放置10min；SolIII=Buffer?P3，Neutrilization?solution.最大速度(12000rpm)下離心12min，將上清液(700μl)轉移到新的Eppendorf管中，用1×酚／氯仿(Phenol／Chloroforum：350μl?Phenol+350μlChlororum，“Choloforum”：24倍體積chloroforum與1倍體積i?soamylalcohol)抽提；在通風櫥中，往Eppendorf管中加入酚和氯仿；渦旋15s，12000rpm下離心2min；將上層相(700μl)小心移入新的Eppendorf管中；傾斜吸取，防止吸入下層的酚／氯仿；用700μlisopropanel沉淀，室溫下放置5min；12000rpmg下離心15min，小心除去上清；先用大移液管移走大部分上清，剩余50μl左右再離心5min；用70％酒精洗滌；加入1ml70％酒精，12000rpm下離心5min，小心移去上清；室溫下晾干；20μlTE+10mg／ml?RNase?A重懸沉淀；在冷室放置一晝夜，后貯于-20℃冰箱；將DNA提取液稀釋100倍，用UV-2450紫外可見分光光度計測定其在波長260nm和280nm波長下的吸收值，OD260／OD280=1.8～1.9為高純度DNA，大于1.9則有RNA污染，小于1.8說明有蛋白質污染；DNA濃度按以下公式計算：DNA濃度(ng／μL)=OD260×50×稀釋倍數；將質粒DNA用0.1％TE溶液稀釋為200μg／mL、500μg／mL、800μg／mL三種濃度，分裝好貯藏在-20℃冰箱中備用；

所述步驟(2)受體材料的準備：紅葉石楠莖段長度為1-1.5em，經0.4mol／L滲透壓培養基(MS培養基添加0.2mol／L甘露醇，0.2mol／L山梨醇)處理4—6h做基因槍轟擊之用；

所述步驟(3)鎢粉預處理：取60mg直徑為1μm的鎢粉，加入1ml無水乙醇，95℃溫育1h，在最大功率下超聲處理3次，每次5min(，離心除去上清；加1ml無水乙醇，旋渦震蕩3—5min，離心除去上清；加1ml無菌水，旋渦震蕩，離心，棄上清，重復3次；用含50％甘油的無菌水懸浮，使其濃度為60mg／ml；

所述步驟(4)微彈制備：取步驟(3)懸浮液50μl，加入6μl質粒DNA(1μg／μl)，20μl亞精胺(0.1M)，50μlCaCl2(2.5M)；震蕩1min，靜置1min，離心，棄上清；加70％乙醇至600μl，200W功率下超聲處理4—6次，每次1秒，離心，棄上清；加150μl無水乙醇，不破壞沉淀，靜置1min，棄上清；加入60μl無水乙醇，震蕩，每次轟擊量5—10μl；

所述步驟(5)基因槍轟擊：基因槍為Bio—Rad?PDS1000／He型，取金粉懸液(60mg，直徑1.5—3.0μm的金粉，用無水乙醇消毒，懸浮于1ml無菌水中)25μl，加入5μgAmGS質粒DNA，50μl2.5mol/LCacl2，20μl0.1mol／L亞精胺，充分混勻，離心，無水乙醇沉淀，重新懸于60μl無水乙醇，備用；可裂膜選用1550psi，將可裂膜、載體膜事先用70％乙醇浸泡半小時，在超凈工作臺晾干；每次吸取10μlDNA-金粉復合體涂布于載體膜，充分晾干；選取生長狀態旺盛、大小一致的愈傷組織進行轟擊，靶材料距離可裂膜5-10cm，每皿受體材料轟擊1次；轟擊后的愈傷組織及時轉到MS固體培養基上恢復生長4—7天，進行篩選，選取生長狀態好的莖段進行農桿菌侵染轉化；

所述步驟(6)受體材料的預培養：選取步驟(3)中恢復篩選后的莖段，長度為1-1.5cm，保留至少一個芽，將莖段淺嵌于分化培養基表面；培養基厚度1-2cm，每瓶培養基體積約15—20ml，每瓶培養基可放6—8個莖段；將嵌入培養基的莖段置于黑暗環境下暗培養2—6d，培養溫度25℃左右；

所述步驟(7)中農桿菌侵染：先將制備好的農桿菌LBA4404菌液和MS母液按1／3—1／2體積比混合，將混合液倒入空的無菌培養瓶并調節pH6.2-6.7；再將預培養的受體材料莖段取出，置于無菌空培養皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，之后于無菌條件下進行適當刻傷，對照材料同時進行同樣刻傷處理；刻傷處理后，將受體材料轉移至已盛有侵染液的培養瓶內侵染15—20min，侵染液體積以沒過侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸；

所述步驟(8)共培養：將侵染后的受體莖段，用無菌濾紙吸干表面液體，轉于表面加蓋一層用MS母液潤濕的無菌濾紙的雙層培養基上，仍按每瓶培養基6—8個莖段放置；將封好口的培養瓶置于黑暗條件下共培養2—4d；

所述步驟(9)中抑菌及卡那霉素篩選培養：將受體材料轉接于含有Kanamycin(卡那霉素)和抑菌素Cefradine(頭孢霉素)的篩選培養基上繼續培養，分3個階段進行(pH6.2—7.0)；第一階段Kan10-15mg／L，Cef350—400mg／L，培養5—8d；第二階段Kan40—45mg／L，Cef300—350mg／L，培養14—21d；第三階段卡Kan45—50mg／L，Cef150—200mg／L，培養20—30d；

所述步驟(10)中轉化植株PCR和Southern?Blotting檢測：經抑菌和篩選培養，受體莖段表現出明顯分離生長狀態，超過1／4的莖段出現由黃花至枯死或者的變化，約3／4莖段萌發出綠色的抗性新芽，CTAB法提取基因組DNA并進行PCR擴增檢測；目的基因引物序列如下：AmGS—F：TCA?TGG?CAC?CTG?ATA?TCA?CCA?CCG?CT；AmGS—R：TAT?TAG?GCA?GCG?GAT?GGG?GCG?GGA?A；反應體系：ddH2O(38.5μL)；Buffer(6μL)；dNTP(2μL)；Primerl(1μL)；Primer2(1μL)；Template?DNA(1μL)；TaqE(0.5μL)；Total(50μL)；擴增程序：反應程序：預變性，94℃，5min；變性，94℃，30sec；復性，55℃，40sec；擴增，72℃，1Min，30cycle；延伸，72℃，10Min；對PCR檢測結果陽性的轉基因植株和未轉基因的對照植株采用PCR標記法進行Southern檢測；具體方法為：用NotI和SacI雙酶切pATCAmGS質粒DNA，DIG—dUTP標記(地高辛雜交檢測試劑盒)，得到800bp的片段為標記探針；預雜交：取10.0mlHyb高效雜交液(Hyb-100)，加入雜交管中，60℃雜交爐中預雜交2h；探針變性：探針在PCR儀中100℃變性10分鐘，立即放冰水浴冷卻5min；雜交：排盡預雜交液，在10.0mlHyb高效雜交液(Hyb-100)加入4.0μl新變性好的探針，混勻，60℃雜交儀中雜交過夜；洗膜、信號檢測。