[發明專利]適于轉化細胞的構建體、系統及其應用

有效

• 申請號: 201410017168.3
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN104774860B
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 李勇;田凱;張歡歡;劉楚新;李飛達;苗澤圃;劉歡;張耕耘
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院;深圳華大三生園科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

提供了適于轉化細胞的構建體、系統及其應用，其中一種適于轉化細胞的構建體包含編碼CaS9的核酸序列，且不包含篩選標記基因。將該適于轉化細胞的構建體與本發明的包含附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中tracrRNA序列與crRNA序列可操作地連接構成gRNAs表達框的另一種適于轉化細胞的構建體配合使用，即利用這兩種構建體共轉染細胞，能夠有效實現對哺乳動物細胞的多種基因的剪切修飾，并獲得無標記細胞株，且切割效率高、安全高效、重復性好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及適于轉化細胞的構建體、系統及其應用，更具體地，涉及兩種配合使用的適于轉化細胞的構建體、適于轉化細胞的系統、轉化細胞的方法以及重組細胞。

背景技術

規律成簇間隔短回文重復（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR）系統是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復結構，CRISPR含有一個與病毒或質粒同源的短重復序列，通過對外來同源的DNA作用影響病毒或質粒的復制，是原核生物的免疫系統一部分。CRISPR重復間隔陣列可以被轉錄成一個長的初級轉錄本，由于該序列包含多個重復片段，可形成多個發夾結構的二級結構，隨后被加工成一個個短的CRISPR RNAs，這些RNA序列包含一段保守的重復片段和一段與外源DNA互補的可變間隔序列，也叫引導序列（guide sequence）。在CRISPR位點附近,存在一系列CRISPR相關基因(CRISPR-associated,Cas)，crRNAs可以和Cas蛋白結合，將Cas蛋白引導到靶序列周圍，誘導雙鏈切割功能，形成DNA雙鏈斷裂。依據核心元件組成和序列的差異，可以將CRISPR/Cas系統分成3類。第I型和第III型CRISPR系統，涉及到多個亞基復合體參與crRNA識別和雙鏈切割。相比而言，第II型CRISPR系統僅包含單一的Cas9蛋白，參與crRNA介導的外源雙鏈切割。

在II型CRISPR系統中，crRNA可以通過堿基對來連接反式活性的RNA（tracr-RNA）來形成復合RNA結構。這種復合RNA結構分子可以指導Cas9蛋白質來在特定位點引入雙鏈DNA的斷裂。而Cas9可以結合tracrRNA：crRNA復合物反過來通過指導其來結合至DNA序列上發揮作用。在這個Cas9–crRNA復合物行使功能的過程中，短間區序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM)起著識別敵我的作用，在靶序列的周圍具有一些短特征序列，如NGG結構，是CAS9行使功能的重要前提。此外，tracrRNA：crRNA復合體可以通過序列融合，形成融合轉錄本，且可以被Cas9高效識別，這類融合RNA也叫引導RNA（guide RNA，gRNAs）。因此，Cas9-gRNA系統中，包含與靶序列完全互補的20個堿基的gRNA介導特異性識別，而Cas9的2個截然不同的活性位點(RuvC and HNH)行使位點特異性切割功能。

目前，CRISPR-Cas9系統已應用于細菌、酵母、斑馬魚、小鼠以及人類細胞基因組修飾等方面。但是，現有的CRISPR-Cas9系統在細胞基因組修飾方面效率較低，不同實驗室結果差異較大；另外，細胞陽性克隆篩選常采用共轉抗性表達載體或流式細胞篩選或單細胞稀釋接種，這些方法具有各自的缺陷，如共轉抗性表達載體篩選獲得單克隆細胞純度低、抗性基因的插入導致生物安全性問題，流式細胞篩選后細胞傷害較大，尤其對于原代細胞，單細胞稀釋接種流程繁瑣、細胞接種密度低導致細胞生長受抑。這些不同不足的存在影響了CRISPR-Cas9系統的廣泛、高效應用。

因而，現階段的CRISPR-Cas9系統仍有待改進。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種切割效率高、安全高效、重復性好、無標記基因修飾細胞的新型CRISPR-Cas9系統。