[發明專利]適于轉化細胞的構建體、系統及其應用有效
| 申請號： | 201410017168.3 | 申請日： | 2014-01-14 |
| 公開（公告）號： | CN104774860B | 公開（公告）日： | 2018-07-17 |
| 發明（設計）人： | 李勇;田凱;張歡歡;劉楚新;李飛達;苗澤圃;劉歡;張耕耘 | 申請（專利權）人： | 深圳華大生命科學研究院;深圳華大三生園科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 李志東 |
| 地址： | 518083 廣東省深*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 構建體 轉化細胞 哺乳動物細胞 篩選標記基因 附著子序列 核酸序列 可操作地 切割效率 應用提供 有效實現 剪切 表達框 共轉染 無標記 細胞株 修飾 細胞 基因 應用 安全 | ||
1.一種適于轉化細胞的構建體，其特征在于，包含編碼CaS9的核酸序列，所述編碼CaS9的核酸序列來源于化膿性鏈球菌，所述編碼Cas9的核酸序列表達Cas9蛋白，所述編碼CaS9的核酸序列為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種適于轉化細胞的構建體，其特征在于，進一步包括第一啟動子，所述第一啟動子與所述編碼CaS9的核酸序列可操作地連接。
3.根據權利要求2所述的一種適于轉化細胞的構建體，其特征在于，所述第一啟動子為CMV啟動子。
4.一種適于轉化細胞的系統，其特征在于，包括：
第一構建體，所述第一構建體為權利要求1～3任一項所述的適于轉化細胞的構建體；以及
第二構建體，所述第二構建體為第二適于轉化細胞的構建體，
所述第二適于轉化細胞的構建體包含：附著子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列與所述crRNA序列可操作地連接構成gRNAs表達框。
5.根據權利要求4所述系統，其特征在于，所述細胞來源于哺乳動物。
6.根據權利要求5所述的系統，其特征在于，所述哺乳動物為豬、牛、羊或小鼠。
7.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述附著子序列為編碼EBNA1的核酸序列。
8.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述tracrRNA序列為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
9.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述crRNA序列為選自GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCA1基因的至少之一的特異位點序列。
10.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述crRNA序列為選自SEQ ID NO：3-38和SEQ ID NO：46-47所示的核苷酸序列的至少一組。
11.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述第二適于轉化細胞的構建體進一步包括第二啟動子，所述第二啟動子與所述gRNAs表達框可操作地連接。
12.根據權利要求11所述的系統，其特征在于，所述第二啟動子為適于表達小片段RNA莖環結構的啟動子。
13.根據權利要求11所述的系統，其特征在于，所述第二啟動子為選自U6和H1啟動子的至少一種。
14.根據權利要求13所述的系統，其特征在于，所述第二啟動子為U6啟動子。
15.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述第二適于轉化細胞的構建體進一步包括篩選標記基因。
16.根據權利要求15所述的系統，其特征在于，所述篩選標記基因為藥物抗性基因。
17.根據權利要求16所述的系統，其特征在于，所述藥物抗性基因為新霉素抗性基因和氨芐青霉素的至少一種。
18.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述第二適于轉化細胞的構建體進一步包括MCS序列。
19.根據權利要求18所述的系統，其特征在于，所述MCS序列由SEQ ID NO：44-45所示的核苷酸序列退火形成。
20.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述第二適于轉化細胞的構建體進一步包括復制起點。
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