[發明專利]楸樹內生真菌的原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201410016834.1
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103756917A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 苗志奇;陳榕華;朱閃爍;于湘莉;唐克軒
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術領域

本發明涉及真菌的生物學領域，尤其是一種楸樹內生真菌的原生質體的制備方法。

背景技術

內生真菌是指那些生活在于植物組織內部并不會使植物產生明顯病害的真菌。內生真菌可以產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質，具有巨大的潛在價值，可以成為新型抗癌藥物的來源。本課題組已從胡桃楸里分離提取了一株具有很強抗癌活力的內生真菌，編號為FSN002，初步鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，木霉菌屬，其發酵提取液對肝癌細胞有很強的抑制作用。這是一個本實驗室獨有的全新菌種，已經在中國專利CN101487022中公開，但其產生的生物活性物質量少、不穩定等缺點限制其進行工業化生產，通過生物轉化、構建突變體等手段對其進行菌體改造，提高其抗癌活力并研究其抗癌機理，可以更好地利用該真菌資源，而構建原生質體是進行以上研究的基礎和關鍵技術。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種楸樹內生真菌的原生質體的制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供一種楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，所述方法包括以下步驟：

步驟1，菌絲體的制備；

步驟2，原生質體的制備；

步驟3，原生質體純化；

步驟4，原生質體再生。

優選地，所述菌絲體制備具體為：取置于-80℃保存的真菌孢子，于室溫下解凍，在無菌操作臺中吸取200μl，加入裝有100ml液體PDA培養基的250ml錐形瓶里，放在搖床上，23～28℃搖晃培養，培養菌絲發酵，用400目無菌金屬過濾篩收集菌絲，放入菌絲清洗液中清洗2次，用無菌吸水紙吸干水分。

優選地,所述菌絲發酵培養條件：在溫度為23～28℃，搖床的轉速為100rpm，搖晃培養時間為12～24h。

優選地，所述原生質體制備具體為：Glucanex酶用滲透壓穩定劑配制為5～30mg/ml的酶液，充分溶解進行酶解，用無菌過濾膜過濾除菌備用。

優選地,所述滲透壓穩定劑為0.7～1mol/L?KCl或NaCl溶液。

優選地,所述酶解的條件為：在溫度為28℃，搖床的轉速為100rpm，時間為4～8h。

優選地,所述原生質體純化具體為：菌絲酶解后用4層無菌擦鏡紙過濾去除菌絲，將濾液收集到離心管中，4000rpm離心10min，棄去上清液，加入原生質體STC保存液重懸原生質體保存。

優選地,所述STC保存液的組成為：1mol/L山梨醇、0.01mol/L?Tris-HCl、0.01mol/L氯化鈣。

優選地,所述原生質體再生具體為：先在培養皿內鋪一層原生質體固體再生培養基，冷凝后備用，制備PDA半固體再生培養基，置于室溫下冷卻至40℃，吸取10ml培養基加入100μL原生質體懸液，混勻，直接倒在培養皿的原有的固體再生培養基上，使之鋪滿平皿形成一固體薄層，待培養基凝固后置于28℃培養箱中培養2～3d，即可見再生菌落。

優選地,所述原生質體固體再生培養基為：加入0.004%的去氧膽酸鈉、1mol/L甘露醇、15g/L瓊脂的PDA固體培養基。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：

（1）本發明所述方法制備的原生質體數量較多，可達到6×10⁷個/毫克菌絲，獲得的原生質體的活力較高，再生率可達到1.2%。

（2）不同菌齡的菌絲細胞壁結構不同，影響原生質體制備，本發明選擇培養12-24h的菌絲體，真菌處于快速生長期，生長快，細胞壁易于Glucanex酶的裂解，釋放出的原生質體的數量多，不易裂解，活力高。

（3）真菌細胞壁成分多、結構復雜，細胞壁裂解酶的選擇對原生質體的制備影響很大，本發明選取5～30mg/ml?Glucanex復合酶作為細胞壁裂解酶液，裂解效率高，原生質體釋放數量多。

（4）滲透壓穩定劑的種類與濃度的選擇對原生質體的制備、再生及原生質體的穩定非常重要，本發明選用0.7～1mol/L?KCl或NaCl作為滲透壓穩定劑，保證了原生質體制備數量與原生質體的穩定。

（5）本發明采用加入0.004%去氧膽酸鈉的雙層高滲PDA再生培養基進行原生質體的再生，提高了原生質體的再生率，并且方便了單克隆菌體的挑選。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：

圖1為實施例1中所制備的原生質體的光學顯微鏡圖像；