[發明專利]楸樹內生真菌的原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201410016834.1
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103756917A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 苗志奇;陳榕華;朱閃爍;于湘莉;唐克軒
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

1.一種楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1，菌絲體的制備；

步驟2，原生質體的制備；

步驟3，原生質體純化；

步驟4，原生質體再生。

2.如權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述菌絲體制備具體為：取置于-80℃保存的真菌孢子，于室溫下解凍，在無菌操作臺中吸取200μl，加入裝有100ml液體PDA培養基的250ml錐形瓶里，放在搖床上，23～28℃搖晃培養，培養菌絲發酵，用400目無菌金屬過濾篩收集菌絲，放入菌絲清洗液中清洗2次，用無菌吸水紙吸干水分。

3.根據權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于,所述菌絲發酵培養條件：在溫度為23～28℃，搖床的轉速為100rpm，搖晃培養時間為12～24h。

4.如權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述原生質體制備具體為：Glucanex酶用滲透壓穩定劑配制為5～30mg/ml的酶液，充分溶解進行酶解，用無菌過濾膜過濾除菌備用。

5.根據權利要求4所述的楸樹內生真菌原生質體制備與再生方法，其特征在于,所述滲透壓穩定劑為0.7～1mol/L?KCl或NaCl溶液。

6.根據權利要求4所述的楸樹內生真菌原生質體制備與再生方法，其特征在于,所述酶解的條件為：在溫度為28℃，搖床的轉速為100rpm，時間為4～8h。

7.如權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述原生質體純化具體為：菌絲酶解后用4層無菌擦鏡紙過濾去除菌絲，將濾液收集到離心管中，4000rpm離心10min，棄去上清液，加入原生質體STC保存液重懸原生質體保存。

8.如權利要求7所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述STC保存液的組成為：1mol/L山梨醇、0.01mol/L?Tris-HCl、0.01mol/L氯化鈣。

9.如權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述原生質體再生具體為：先在培養皿內鋪一層原生質體固體再生培養基，冷凝后備用，制備PDA半固體再生培養基，置于室溫下冷卻至40℃，吸取10ml培養基加入100μL原生質體懸液，混勻，直接倒在培養皿的原有的固體再生培養基上，使之鋪滿平皿形成一固體薄層，待培養基凝固后置于28℃培養箱中培養2～3d，即可見再生菌落。

10.如權利要求1所述的楸樹內生真菌的原生質體的制備方法，其特征在于，所述原生質體固體再生培養基為：加入0.004%的去氧膽酸鈉、1mol/L甘露醇、15g/L瓊脂的PDA固體培養基。