[發明專利]超螺旋DNA含量的測定方法

無效

• 申請號: 201410015213.1
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103852530A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 王學海;李杰;李莉娥;許勇;何昆;陳愛芳;呂興凱;田呂明;馬梵辛;楊仲文;涂榮華;肖強;張緒文;馬錚;裴達;黃韞韜
• 申請（專利權）人: 人福醫藥集團股份公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物領域，具體而言，本發明涉及一種超螺旋DNA含量的測定方法。

背景技術

在質粒類生物制品工業化生產中，超螺旋DNA是最終的目的產品。然而質粒DNA不僅與RNA、蛋白質等雜質摻合在一起，其中還有少量開環DNA的存在，進而在實際檢測過程中干擾超螺旋DNA色譜峰，影響最終定量檢測。現有檢測超螺旋DNA含量技術中采用的毛細管凝膠電泳法或者瓊脂糖凝膠電泳法均存在檢測方法上的不足，如毛細管凝膠電泳法需要繁瑣的樣品處理，且不適合在質粒DNA生產的每一步中使用；瓊脂糖凝膠電泳法在OD₂₆₀波長下檢測范圍太窄，并且樣品稀釋過程中很容易造成誤差，準確度很低，也不適合在質粒DNA生產的每一步中使用。更重要地，是上述兩種方法均無法定量地檢測超螺旋DNA的含量。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種實現質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質基線分離、定量檢測超螺旋DNA含量的檢測方法。

根據本發明的一個方面，本發明提出了一種超螺旋DNA含量的測定方法，該方法包括：采用AKTAexplorer^TM10檢測儀器并利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理，以便獲得總DNA樣品，計算總DNA樣品的質量含量；以及采用嗜硫芳香色譜柱對所述總DNA樣品進行第二檢測分離處理，并計算超螺旋DNA在所述待測樣品中的質量含量。

由此采用分子篩層析法使得RNA、蛋白質等雜質在內水體積中流出，而質粒DNA從外水體積中流出，完美地實現質粒DNA從RNA、蛋白質等其他雜質中的基線分離，減少了RNA、蛋白質等雜質在檢測過程中對質粒DNA的干擾。在此基礎上，利用吡啶環硫醚基團對超螺旋DNA的特異性親和能力，實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，通過計算兩種DNA在色譜圖中對應的峰面積，進而定量地測定超螺旋DNA在總DNA中的確切含量。本發明上述實施例的測定超螺旋DNA含量的測定方法與毛細管凝膠電泳法和瓊脂糖凝膠電泳法相比，操作過程簡單，檢測過程中受雜質峰干擾小，具有安全、可靠、定量的特點，由此更加適用于實際工業化生產，效果良好。

另外，根據本發明上述實施例的超螺旋DNA含量的測定方法還可以具有如下附加的技術特征：

在本發明的一些實施例中，所述第一檢測分離處理和所述第二檢測分離處理采用的紫外檢測波長分別為OD₂₆₀。由此可以進一步地減少RNA、蛋白質與開環DNA等雜質峰的干擾，提高超螺旋DNA含量測定的準確度。

在本發明的一些實施例中，所述分子篩色譜柱為5ml-HiTrap?Sepharose?HP色譜柱。由此可以實現質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質的完美分離，得到DNA總含量。

在本發明的一些實施例中，所述嗜硫芳香色譜柱為1ml-HiTrap?PlasmidSelect?Xtra色譜柱。由此可以

在本發明的一些實施例中，所述第一檢測分離處理是采用流動相A進行第一洗脫完成的，所述流動相A包含2.1M(NH₄)₂SO₄、10mM?EDTA以及100mM?Tris-Hcl，pH7.5。由此可以減少RNA、蛋白質等雜質的含量，降低RNA、蛋白質等雜質在色譜圖中的干擾，進一步地提高超螺旋DNA含量的檢測準確度。

在本發明的一些實施例中，所述第一洗脫的線性流速為60cm/h。由此可以進一步地提高檢測的準確度。

在本發明的一些實施例中，所述第二檢測分離處理是采用流動相B和流動相C進行第二洗脫完成的，所述流動相B包含2.25M(NH₄)₂SO₄、10mM?EDTA以及100mM?Tris-Hcl，pH7.5，所述流動相C包含2.0M?NaCl、10mM?EDTA以及100mM?Tris-Hcl，pH7.5。

在本發明的一些實施例中，所述第二洗脫是以（100%流動相B、0%流動相C）～（45%流動相B、55%流動相C）的梯度洗脫方式進行的。由此可以進一步地實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，減少雜質峰干擾，提高檢測的靈敏度與準確度。

在本發明的一些實施例中，所述第二洗脫的線性流速為60cm/h，所述第二洗脫的洗脫體積為11個柱體積。由此可以進一步地提高檢測的準確度。

本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。