[發明專利]一種梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP分子標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201410014478.X
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103740828A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 吳俊;張紹鈴;李雷廷;齊開杰;劉倫;謝智華;陳惠
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種與梨果實果梗長度主效QTL位點緊密連鎖的SNP標記引物，其特征在于：

正向引物LFP-F???5’-?TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3’

反向引物LFP-R???5’-?GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3’

該引物用來檢測登錄號為AJSU00000000的梨基因組序列scaffold278.0的第502462個堿基處是否存在一個與梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095，同時檢測QTL位點?Pyb07_095上的多態性表達果梗長度大小的差異，該位點位于第7連鎖群的33.5?cM處，其解釋了遺傳變異的25.68%，對應的SNP標記為Pyb07_095，LOD值為9.19。

2.權利要求1所述引物用于檢測梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP標記方法，其特征在于：

HRM?反應體系按照?LightCycler^??480?High?Resolution?Melting?Master?試劑盒中的說明書進行，HRM?分析是在LightCycler^??480?II?熒光定量PCR?儀上進行；

10?μL反應體系：含有2?ng?·?μL^-1?梨基因組DNA?模板、1?×?Master?Mix、2.0?mmol?·?L^-1?MgCl₂、0.2?mmol?·?L^-1?權利要求1所述的引物；

擴增程序采用降落式PCR：95?℃預變性10?min，然后95?℃?變性10?s、60?~?55?℃，每循環下降0.5?℃，退火15?s、72?℃?延伸12?s的程序進行45?個循環；如果擴增產物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095；

PCR?循環結束后進行熔解，其程序為：?95?°C?1?min，?40?°C?1?min，?65?°C?1?s，再從?65?°C連續升溫至95?°C，每升高0.04?°C，收集熒光1次，最后降溫至40?°C；

最后，在LightCycler^??480?II?的Gene?Scanning?軟件中1.5?version自動生成擴增產物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上表達的果梗長度大的品種和表達的果梗長度小的品種為對照，檢測QTL位點Pyb07_095上的多態性表達果梗長度大小的差異，如果未知品種得到的擴增產物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果實果梗長度主效QTL位點Pyb07_095上的多態性表達的果梗長度大小和對照相似。

3.根據權利要求2所述的方法，所述的已知具有與梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上表達的果梗長度大的品種為‘碭山酥梨’，表達的果梗長度小的品種為‘八月紅’。

4.權利要求1所述引物在梨分子育種中的應用。

5.權利要求2或3所述方法在梨分子育種中的應用。