[發明專利]一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410013902.9
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103757108A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張西臣;于艷輝;李建華;宮鵬濤;王力;劉麗;張國才;楊舉;張楠;李赫;楊正濤
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明涉及陰道毛滴蟲的診斷和檢測技術，更確切地說是提供了一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒，屬于寄生蟲檢測技術領域。

背景技術

陰道毛滴蟲病是由陰道毛滴蟲引起人獸共患的一種非病毒性性傳播疾病。陰道毛滴蟲主要引起男、女泌尿生殖系統疾病；也可引起孕婦流產、早產、胎膜早破、低體重兒及圍產期感染；此外，陰道毛滴蟲感染可以增加HIV，淋病等性傳播疾病的感染機率,更可增加女性癌癥發病率。

陰道毛滴蟲培養方法作為診斷的金標準。Diamond’s培養基是培養陰道毛滴蟲比較完善的方法，但并未普及。目前，陰道毛滴蟲病的診斷及檢測方法主要有病原學診斷和免疫學診斷等。其中，病原學檢測陰道毛滴蟲最常用的方法是濕片鏡檢法，此法費時、費力，且檢出率低；免疫學檢測方法主要有間接血凝試驗（IHA）、免疫熒光試驗（IFA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、單克隆抗體（McAb）等方法；但存在敏感性低等問題。而分子生物學PCR診斷方法具有靈敏度高等優點廣泛用于病原的檢測。目前臨床上尚無陰道毛滴蟲PCR檢測試劑盒的應用。因此，開發一種特異且靈敏高的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒已是迫在眉睫。

發明內容

本發明提供了一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒，用于陰道毛滴蟲的診斷和檢測。

本發明提供的陰道毛滴蟲G3粘附蛋白AP51-3基因診斷序列，如SEQ?ID?NO:1所示。

本發明還公開了的一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒，是通過以下方法制成的：

（1）DNA裂解液：含不同濃度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；

其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

（2）PCR反應液：終濃度各100-300μM的4種dNTPs，終濃度各10-100pmol/μl的上游引物（F₁），下游引物(R₁)，內側上游引物(F₂)，內側下游引物(R₂)，1.5-4.5mM的Mg²⁺濃度；Taq酶按每個PCR反應（20μl）含2.0?U加入，反應液中不含Taq酶；

（3）陰道毛滴蟲巢氏特異性引物：

F₁：GCCCGTAACTTCAACATCC???

R₁：TCCTCAACACCGTTCTCGT???

F₂：AAGGCTCAGGTCTACTGTGGT???

R₂：ATTGTCTGGGCAACTTCCTCT??

（4）陽性對照：陽性對照為陰道毛滴蟲基因組DNA，比較PCR產物以及監測PCR操作過程是否正確。

本發明的試劑盒還可以含有瓊脂糖（Agarose）、溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶，其濃度優選為溴化乙錠10μg/μl；溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶?5U/μl。也還可以含有PCR反應管。

本發明所述的一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1）樣本的預處理：將標本3000r/min，10min，棄上清，留取沉淀。

2）樣本DNA的提取：

（1）將上述沉淀轉移到1.5ml離心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反復凍融三次；

（2）將凍融后的樣品加入5-6μl（20mg/ml）蛋白酶K，使其終濃度為100μg/ml。混勻后在65℃水浴中浸泡2h；

（3）用酚:氯仿:異戊醇（24:25:1）進行抽提兩次，7000r/min離心10分鐘；

3）PCR擴增：

（1）準備待檢樣品數+2的PCR反應管，管內包括PCR液、Taq酶等，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用；

（2）將陰性和陽性對照分別加入標記好的管中，然后把樣品依次加入并標記好，置于PCR儀中。第一輪PCR條件為：95℃預變性5min、94℃變性45s、57℃退火45s、72℃延伸30s,?共30個循環，后72℃延伸10min；第二輪PCR條件為：95℃預變性5min、94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸30s,?共30個循環，后72℃延伸10min.

4）PCR產物觀察：