[發(fā)明專利]一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410013902.9
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103757108A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 張西臣;于艷輝;李建華;宮鵬濤;王力;劉麗;張國才;楊舉;張楠;李赫;楊正濤
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種陰道毛滴蟲G3粘附蛋白AP51-3基因診斷序列，如SEQ?ID?NO:1所示。

2.?一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒，是通過以下方法制成的：

1）DNA裂解液：含不同濃度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；

其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

2）PCR反應液：終濃度各100-300μM的4種dNTPs，終濃度各10-100pmol/μl的上游引物（F₁），下游引物(R₁)，內(nèi)側(cè)上游引物(F₂)，內(nèi)側(cè)下游引物(R₂)，1.5-4.5mM的Mg²⁺濃度；Taq酶按每個PCR反應（20μl）含2.0?U加入，反應液中不含Taq酶；

3）陰道毛滴蟲巢氏特異性引物：

F₁：GCCCGTAACTTCAACATCC???

R₁：TCCTCAACACCGTTCTCGT???

F₂：AAGGCTCAGGTCTACTGTGGT???

R₂：ATTGTCTGGGCAACTTCCTCT；?

4）陽性對照：陽性對照為陰道毛滴蟲基因組DNA，比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確。

3.一種特異的陰道毛滴蟲巢氏PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1）樣本的預處理：將標本3000r/min，10min，棄上清，留取沉淀；

2）樣本DNA的提取：

（1）將上述沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反復凍融三次；

（2）將凍融后的樣品加入5-6μl（20mg/ml）蛋白酶K，使其終濃度為100μg/ml；混勻后在65℃水浴中浸泡2h；

（3）用酚:氯仿:異戊醇（24:25:1）進行抽提兩次，7000r/min離心10分鐘；

3）PCR擴增：

（1）準備待檢樣品數(shù)+2的PCR反應管，管內(nèi)包括PCR液、Taq酶等，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用；

（2）將陰性和陽性對照分別加入標記好的管中，然后把樣品依次加入并標記好，置于PCR儀中；第一輪PCR條件為：95℃預變性5min、94℃變性45s、57℃退火45s、72℃延伸30s,?共30個循環(huán)，后72℃延伸10min；第二輪PCR條件為：95℃預變性5min、94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸30s,?共30個循環(huán)，后72℃延伸10min.

4）PCR產(chǎn)物觀察：

稱取瓊脂糖，用電泳液混勻后（0.8%-1.0%）在微波爐中加熱三分鐘；等膠冷卻后在加樣孔中分別加樣，100V電壓下電泳10分鐘，之后在紫外燈下觀察實驗結(jié)果；第一輪PCR產(chǎn)物571bp，第二輪PCR產(chǎn)物377bp。