[發明專利]一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法

有效

• 申請號: 201410013791.1
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103755955A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 劉杰;蔣慶;高迪;陳可欣;余柏青
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C08G69/48
• 分類號: C08G69/48;C08G69/14;C08G69/16;C12N15/87
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 姜若天

技術領域

??本發明涉及非病毒基因載體領域，具體地說，涉及一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法。

背景技術

隨著以DNA重組技術為代表的現代分子生物學技術的發展，基因治療已成為近20年來生物醫學治療技術研究的熱點之一。基因治療是指將特定的外源基因運載到病灶部位的細胞內，并使其有效地表達。作為一種從根本上治療疾病的新型醫療方法，基因治療面臨的首要挑戰是如何把治療基因安全、高效地運到病變部位的靶細胞或組織中，并且穩定地表達，這在很大程度上取決于基因治療所用的載體系統。目前，應用于基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。

病毒載體高度進化后具有一定的感染和寄生特性，在多數情況下有較高的轉染效率，但也存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差、制備復雜及費用高等缺點，從而導致其在臨床上的應用受到了限制，于是人們逐漸將目光轉向了非病毒載體。陽離子聚合物是一類重要的非病毒載體，其具有安全、有效、無免疫原性等特點。目前，研究最為廣泛和深入的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺（PEI）。聚乙烯亞胺（PEI）分子中每三個相鄰原子中就有一個可以質子化的氮原子，較高的電荷密度可以使其與基因有效的結合并增強了細胞的攝取，很大程度上提高了基因轉染效率。但PEI作為基因載體材料在體內生物降解性較差，易導致紅細胞的聚集而且能夠和血漿的成分相互作用，細胞毒性也相對較大。因此，開發一種高效、低毒以及生物相容性較好的非病毒基因載體非常必要。

聚氨基酸是α-氨基酸之間由肽鍵相連的高分子，具有較好的生物相容性；除此之外，在生理環境下，聚氨基酸可自發形成穩定的二級結構，保證了其作為載體材料的穩定性，因而聚氨基酸在眾多高分子材料中獨樹一幟。目前研究及應用較多的氨基酸類基因載體為聚賴氨酸。聚賴氨酸(PLL)由于其側鏈的伯胺基團在生理環境(pH=7.4)下便可質子化而帶正電，因此可以有效的提高DNA的包載率，增加細胞的攝取效率，然而研究表明聚賴氨酸的質子緩沖能力欠缺，以其作為載體的復合微粒難以從內含體中逃逸，最終負載的基因被核酸酶降解，轉染效率下降。

在眾多氨基酸中，天冬氨酸(Aspartate?Acid)具有α-手性中心以及多種官能團，無論是自身均聚還是與其他氨基酸共聚，都保留著部分活性基團，因此具有結構可控、易于修飾的優點，可以制備成效率高、毒性低的高分子基因載體材料。同時，還可以通過在其母體引入不同鏈長、含不同親疏水性基團的側鏈，賦于材料不同的性質，如荷電性、親水性、親脂性等，最終使材料具有不同的生物降解性；組氨酸(Histidine)是一種側基為咪唑基的人體常見非必需氨基酸，PKa約為6.0，聚合物中引入組氨酸可以提高其在細胞質內含體及溶酶體內pH(4.5~6.5)中的質子緩沖能力，有利于復合微粒從內含體逃逸，避免微粒在溶酶體中被降解，同時，生理環境下，組氨酸具有疏水特性，可以提高基因載體的細胞攝取，從而進一步提高基因轉染效率。

因此，在上述相關基礎上，設計開發一類全新的具有可控分子結構的氨基酸陽離子無規共聚物，其主鏈結構中同時包含生物相容性良好和基因攜載能力高的陽離子天冬氨酸單體，以及能夠有效促進載體內含體逃逸的疏水性組氨酸單體，并在此基礎上將其進一步發展，制備成為一系列新型的高效、低毒的基因載體，目前還未見有相關研究報道。

發明內容

本發明目的是克服現有技術的不足，提供一種低毒、高效的陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法。本發明的載體材料能夠有效的結合基因并利用組氨酸在酸性環境下的強質子緩沖能力，幫助自身及基因有效逃離內含體，同時，聚天冬氨酸主鏈引入疏水的組氨酸單體后，有效的降低了電荷密度并提高細胞的攝取效率。

?????為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種陽離子聚氨基酸基因載體材料，其結構式如式（Ⅰ）所述：

（Ⅰ）

式（Ⅰ）中，?x、y為兩種氨基酸單元結構數量，與聚氨基酸的分子量有關。n為胺解后天冬氨酸保持芐酯為其側鏈的單元結構數量，x-n為胺解后天冬氨酸側鏈修飾了二乙烯三胺的單元結構數量，x、x-n均與聚合物的胺解程度有關，?目標單體摩爾比例組氨酸：天冬氨酸=1：20~1：1；聚合物的分子量為3500~100000；胺解比例從10%至95%的聚合物；相應地，x、y及n的范圍如下：11<x<480，1<y<295，1<n<423，x、y及n均為整數。