[發(fā)明專利]一種甘藍小孢子單倍體植株加倍的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410011524.0
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN103749300A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 張恩慧;楊安平;程永安;許忠民;程芳芳;董韓;唐桃霞
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發(fā)明屬于甘藍育種技術領域，涉及利用甘藍小孢子單倍體植株莖生葉通過離體組織培養(yǎng)技術實現(xiàn)小孢子單倍體植株加倍獲得再生雙單倍體植株的方法。

背景技術

甘藍為二倍體2n=2x=18異花授粉植物，其雜交種由基因型純合的兩個親本配制而成。甘藍小孢子培養(yǎng)是創(chuàng)制基因型純合的雙單倍體植株（Double?haploid?plants，簡稱DH株）親本的一條重要途徑，其除具有諸多優(yōu)點外，最大缺點是小孢子植株群中單倍體植株（Haploid?plants，簡稱H植株）比率高，嚴重影響著甘藍單倍體育種效果。通常甘藍小孢子再生植株群體中僅有10?%～50?%可自然加倍形成的雙單倍體植株，由此表明相當一部分由甘藍小孢子再生的單倍體植株不能自然加倍成為雙單倍體植株，使其不能正常開花結籽和配制雜交種，達不到有效創(chuàng)制新資源的目的。因而，甘藍育種家致力于甘藍單倍體植株加倍的技術研究，常規(guī)方法主要有兩種，一種是在小孢子熱激培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中添加秋水仙素，提高小孢子再生植株群中DH株比率，一般達30?%～80?%，加倍效果主要受基因型影響比較大；另一種是用秋水仙素涂抹或浸泡單倍體植株生長點或根系加倍染色體，進一步誘導發(fā)育成雙單倍體或多倍體。前一種方法可得到較高加倍率，但還存在一定數(shù)量的H植株未能被充分利用，后一種方法除獲得加倍植株難度較大外，加倍率為30%左右，加倍過程中單倍體植株易死亡，對于甘藍小孢子培養(yǎng)中每粒小孢子僅再生1棵植株，后一種方法不能保證每棵單倍體植株能夠獲得加倍后代或保證植株存活。

發(fā)明內容

針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題與不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種甘藍小孢子單倍體植株加倍的方法。該方法首次利用甘藍小孢子單倍體開花植株的花薹莖生葉片作為外植體，通過研制的秋水仙素和6-BA混合液浸泡后再經(jīng)離體組織培養(yǎng)獲得雙單倍體植株，擬將保證每個甘藍小孢子單倍體植株能夠獲得再生雙單倍體植株，其比培養(yǎng)基添加秋水仙素離體培養(yǎng)和秋水仙素涂抹生長點加倍方法獲得顯著效果，由此解決了甘藍單倍體植株不能加倍或加倍效率低的難題，極大地提高了甘藍小孢子培養(yǎng)效率。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下的技術解決方案：一種甘藍小孢子單倍體植株加倍的方法，包括下列步驟：?

1）選擇小孢子單倍體植株花薹莖生幼嫩葉片，切成1cm²左右的小片作為離體培養(yǎng)的外植體；

2）將無菌外植體放入外植體浸泡溶液中浸泡24h～48h；

3）把浸泡后的外植體接種到培養(yǎng)瓶內的外植體誘導培養(yǎng)基上，在溫度25℃下，暗培養(yǎng)25d，隨后轉入光培養(yǎng)，12h～14h/d光照，光照強度?2000～2500Lx，經(jīng)20～25天誘導出不定芽；

4）待不定芽生長至3.0～3.5?cm高，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶內的生根培養(yǎng)基上，在溫度?25℃，12h～14h/d光照，光照強度?2500～3000Lx的條件下培養(yǎng)，經(jīng)20～25d誘導生根，獲得再生苗；

5）將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開，室內鍛煉3～5天，再移田間遮陽網(wǎng)棚鍛煉2～3天，隨后從培養(yǎng)瓶中取出再生苗，洗去根部的培養(yǎng)基浸蘸殺菌藥劑，直接移栽到紗網(wǎng)棚內，栽培促其生長，翌年再生植株抽薹開花，采用再生植株形態(tài)學觀察與氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法結合的方法鑒定倍性，獲得加倍的雙單倍體植株。

所述的外植體浸泡溶液是含有濃度為0.2～10?mg/L秋水仙素和濃度為1.0～5.0?mg/L6-BA的蒸餾水溶液。?

所述的外植體誘導培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖、8g/L瓊脂、2.0mg/L的6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）及0.1mg/L的NAA（α-萘乙酸），pH值為5.8～6.0。

所述的生根培養(yǎng)基為：?MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖、8g/L瓊脂和0.1～1.0mg/L的NAA（α-萘乙酸）、0.01mg/L稀效唑，pH值為5.8～6.0。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明研制出秋水仙素中添加一種細胞分裂素（6-芐氨基腺嘌呤（6-BA））離體浸泡加倍溶液，采用外植體浸泡后再離體培養(yǎng)的方法替代在培養(yǎng)基中添加秋水仙素誘導加倍培養(yǎng)的方法，獲得加倍率至少高出2倍的結果。