[發(fā)明專利]PKCα-siRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建、篩選方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410011031.7
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103773789A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王金華;趙麗君
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省腫瘤防治研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 北京紐樂康知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11210
• 代理人: 張朝元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，尤其涉及一種PKCα-siRNA質(zhì)粒載體的的構(gòu)建、篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

化療是繼外科手術(shù)外治療腫瘤的主要有效手段。不幸地是，多藥耐藥（multidrug?resistance,?MDR）的產(chǎn)生嚴重影響了化療效果。因此，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥已成為目前腫瘤治療研究的重點。

蛋白激酶C(Protein?Kinase?C，PKC)是一種磷脂依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起重要作用。PKC是一類同工酶家族，它們經(jīng)生長因子、激素及神經(jīng)轉(zhuǎn)化因子作用后發(fā)生磷酸化或活化。其中，蛋白激酶C同工酶-α（PKC-α）廣泛存在于各種組織中，具有維持細胞增殖與凋亡之間平衡的作用。在許多轉(zhuǎn)化細胞及腫瘤細胞中常常發(fā)現(xiàn)PKC-α的異常表達。PKC-α的表達水平與腫瘤細胞的侵襲能力密切相關(guān)。近年來研究表明，PKC-α在腫瘤多藥耐藥機理上有著重要作用，PKC-α是MDR發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，可以作為癌癥治療的一個靶點。PKC-α的過度表達與MDR表型的高表達有著密切關(guān)系。PKC-α的活化可導(dǎo)致耐藥蛋白P-gp170的磷酸化及細胞內(nèi)藥物濃度的下降，而抑制PKC的表達能部分逆轉(zhuǎn)MDR表型。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將PKC-α基因轉(zhuǎn)染到MCF-7乳腺癌細胞中，發(fā)現(xiàn)MCF-7對多柔比星和長春新堿的耐藥性得到提高。在臨床上，腫瘤患者中PKC-α表達陽性者的化療反應(yīng)率明顯低于陰性表達者，復(fù)發(fā)患者中PKC-α陽性表達率明顯高于未復(fù)發(fā)的患者。

1998年,Fire等首次將正義鏈和反義鏈的RNA混合物——雙鏈RNA注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨注射正義鏈或反義鏈都要強的多的基因沉默,他們將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾(small?RNAs?mediating?RNA?interference,?RNAi)，從而獲得2006年諾貝爾獎。RNAi作為真核生物中普遍存在的一種自然現(xiàn)象,是利用雙鏈RNA誘發(fā)宿主細胞同源mRNA降解,從而抑制特異目的基因表達的方法。隨著RNAi的深入研究，RNAi已成為腫瘤研究中的一個熱點，RNAi技術(shù)在癌基因及抑癌基因的敲除、腫瘤疾病信號傳導(dǎo)途徑以及腫瘤免疫逃逸等方面的研究都被廣泛開展。而近來,?RNAi技術(shù)在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥方面的研究正成為當前腫瘤學研究熱點之一。針對不同的耐藥機制,設(shè)計不同的小分子干擾RNA（small?interference?RNA,?SiRNA）來逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,已經(jīng)成為研究腫瘤耐藥和腫瘤基因治療的重要組成部分。目前，雖然有關(guān)沉默PKC-α基因的siRNA質(zhì)粒載體尚有一些報道，但仍存在許多問題限制其應(yīng)用和發(fā)展。例如：導(dǎo)入腫瘤耐藥細胞的成功率不高；沉默PKC-α基因的siRNA質(zhì)粒載體的特異性和靈敏度不夠等，這對于基因調(diào)控逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物研發(fā)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種PKCα-siRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建、篩選方法及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種PKCα-siRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其篩選方法，包括以下步驟：

1）設(shè)計及合成靶向PKCα的siRNA，進一步包括以下步驟：

1.1）根據(jù)基因庫PKCα基因序列篩選出候選序列；

1.2）根據(jù)RNAi目標序列的選取原則優(yōu)化siRNA序列；

1.3）確定靶向PKC-α的siRNA?的目標序列；

2）構(gòu)建PKC-α?siRNA的重組質(zhì)粒載體，進一步包括以下步驟：

2.1）退火連接單鏈目的基因片段；

2.2）Eco31I酶切質(zhì)粒pEGFP-iLenti；

2.3）1％瓊脂糖凝膠回收酶切線性空載體；

2.4）連接線性化質(zhì)粒載體；

2.5）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞及擴增；

2.6）純化重組質(zhì)粒。

進一步的，步驟1.2）根據(jù)RNAi目標序列的選取原則優(yōu)化siRNA序列，進一步包括以下步驟：

1.2.1）從轉(zhuǎn)錄本的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點；

1.2.2）利用BLAST軟件將候選序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，排除和其他編碼序列或基因表達序列標簽同源的候選序列；

1.2.3）選出合適的目標序列。

進一步的，步驟1.3）中確定的目標序列為：

5'-492?AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3',