[發明專利]PKCα-siRNA質粒載體的構建、篩選方法及應用在審
| 申請號： | 201410011031.7 | 申請日： | 2014-01-09 |
| 公開（公告）號： | CN103773789A | 公開（公告）日： | 2014-05-07 |
| 發明（設計）人： | 王金華;趙麗君 | 申請（專利權）人： | 江蘇省腫瘤防治研究所 |
| 主分類號： | C12N15/66 | 分類號： | C12N15/66;C12Q1/68;G01N33/68 |
| 代理公司： | 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙) 11210 | 代理人： | 張朝元 |
| 地址： | 210000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | pkc sirna 質粒 載體 構建 篩選 方法 應用 | ||
1.一種PKCα-siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）設計及合成靶向PKCα的siRNA，進一步包括以下步驟：
1.1）根據基因庫PKCα基因序列篩選出候選序列；
1.2）根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列；
1.3）確定靶向PKC-α的siRNA的目標序列；
2）構建PKC-α?siRNA的重組質粒載體，進一步包括以下步驟：
2.1）退火連接單鏈目的基因片段；
2.2）Eco31I酶切質粒pEGFP-iLenti；
2.3）1％瓊脂糖凝膠回收酶切線性空載體；
2.4）連接線性化質粒載體；
2.5）重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞及擴增；
2.6）純化重組質粒。
2.根據權利要求1所述的PKCα-siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于：步驟1.2）根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列，進一步包括以下步驟：
1.2.1）從轉錄本的AUG起始密碼開始，尋找AA二連序列，記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點；
1.2.2）利用BLAST軟件將候選序列和相應的基因組數據庫進行比較，排除和其他編碼序列或基因表達序列標簽同源的候選序列；
1.2.3）選出合適的目標序列。
3.根據權利要求2所述的PKCα-siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于：步驟1.3）中確定的目標序列為：
5'-492?AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3',
5'-746?GAACAACAAGGAATGACTT-3',
5'-1114?AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3',
5'-1676?AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3'。
4.權利要求1-3任一項所述的構建及其篩選方法獲得的PKCα-siRNA?492質粒載體逆轉腫瘤耐藥表型的用途。
5.權利要求1-3任一項所述的構建及其篩選方法方法獲得的PKCα-siRNA?492質粒載體提高腫瘤耐藥細胞株的藥物敏感性的用途。
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