[發(fā)明專利]一種非cry基因啟動子指導的Cry蛋白表達載體、構(gòu)建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410010899.5
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103740748A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 彭琦;宋福平;束長龍;耿麗麗;黃大昉;張杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/07
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及非cry基因啟動子指導的Cry蛋白表達載體構(gòu)建方法及其應用。?

背景技術(shù)

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus?thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢菌，廣泛分布于自然界中，Bt屬于蠟樣芽胞桿菌族(B.cereus?group，Bc)，與其它Bc族細菌相比，Bt最大的特點是在芽胞期母細胞中形成主要由Cry蛋白和Cyt蛋白組成的伴胞晶體（Aronson?AI,Shai?Y.Why?Bacillus?thuringiensis?insecticidal?toxins?are?so?effective:unique?features?of?their?mode?of?action.FEMS?Microbiology?Letters,2001,195(1):1-8.）。由于Cry蛋白對多種重要農(nóng)業(yè)害蟲有特異的殺蟲活性，且具有對人畜無害、不污染環(huán)境、無殘留、生產(chǎn)原料及殺蟲成分為天然產(chǎn)物、能保持生態(tài)平衡等優(yōu)點，已成為世界上應用最廣泛的微生物殺蟲劑（Raymond?B,Johnston?PR,Nielsen-LeRoux?C,Lereclus?D,Crickmore?N.Bacillus?thuringiensis:an?impotent?pathogen?Trends?in?microbiology,2010,18(5):189-194.）。?

目前全世界已發(fā)現(xiàn)725種Cry蛋白（截止到2013年12月），根據(jù)蛋白的氨基酸序列同源性被分為72大類。Bt產(chǎn)生的由Cry蛋白組成的伴胞晶體可達細胞干重的20%以上，這主要是由于cry基因強啟動子確保了mRNA持續(xù)且大量的生成，并且mRNA的穩(wěn)定性在cry基因大量表達方面至關(guān)重要（邵宗澤,喻子牛.蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白超量表達的機制.生命科學,2000,8(12):173-176.）。根據(jù)其調(diào)控機制的不同，分為以cry1Ac基因為代表的芽胞依賴型cry基因和以cry3A基因為代表的非芽胞依賴型cry基因（Agaisse?H,Lereclus?D.How?does?Bacillus?thuringiensis?produce?so?much?insecticidal?crystal?protein?Journal?of?bacteriology,1995,177(21):6027.Mahadeva?Swamy?H,Asokan?R,Thimmegowda?GG,Mahmood?R.Expression?of?cry3A?gene?and?its?toxicity?against?Asian?Gray?Weevil?Myllocerus?undecimpustulatus?undatus?Marshall(Coleoptera:Curculionidae).Journal?of?basic?microbiology,2013.）。?

蘇云金芽胞桿菌因其是優(yōu)良的生物農(nóng)藥，一直被廣泛關(guān)注。尋找強啟動子表達Cry蛋白，已經(jīng)成為一種提高晶體蛋白產(chǎn)量的途徑。已有報道表明，利用cry8E啟動子表達cry1Ac基因，通過構(gòu)建Bt高效表達載體pHT315-8E21b提高了Cry1Ac蛋白的產(chǎn)量（李朝睿,杜立新,彭琦,梁影屏,高繼國,張杰,宋福平.蘇云金芽胞桿菌高效表達載體的構(gòu)建.微生物學通報,2013,40(2):350-361.）。但是，Cry蛋白的啟動子類型有限，可選擇構(gòu)建高效表達載體的高活性的cry?基因啟動子更是極少。因此，若利用高活性的非cry基因啟動子指導Cry蛋白的表達，對提高具有高效殺蟲活性、持效期長的Bt制劑有非常廣闊的應用前景。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是選取編碼芽胞外壁基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的exsY基因，比較其長短不同的兩段啟動子活性的強弱，篩選出一個強啟動子，指導cry基因的表達。?

目的之二是應用篩選出的高活性的exsY基因啟動子，構(gòu)建一個指導Cry1Ac蛋白表達的載體，對其效率進行評估，以用于研制更為高效廣譜的蘇云金芽胞桿菌工程菌。?

一種表達載體，其結(jié)構(gòu)特征為：將exsY基因啟動子PexsY與cry基因融合，重疊片段插入經(jīng)酶切后的骨架載體pHT315的多克隆位點之間，所述啟動子PexsY的序列如SEQ?ID?NO9所示。?

所述表達載體為pHT315-PexsY-1Ac，所述cry基因為cry1Ac基因，其序列如SEQ?IDNO1所示。?