[發明專利]柚木無性系指紋圖譜的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201410010871.1
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103725785A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 黃桂華;梁坤南;周再知;馬華明
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院熱帶林業研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明涉及一種喬木無性系指紋圖譜的構建方法及其應用，具體涉及一種柚木無性系指紋圖譜的構建方法及其應用。

背景技術

柚木（Tectona?grandis?L.f.）為馬鞭草科（Verbenaceae）柚木屬（Tectona）高大喬木，天然分布于北緯9°～26°，東經73°～104°的印度南部與中部、泰國北部、緬甸和老撾，是世界著名的熱帶珍貴用材樹種，素有“萬木之王”的美譽，其心材材質堅韌耐久，結構致密，紋理美觀，是制造軍艦、碼頭、橋梁、建筑、家具、雕刻和木地板等的高級用材。全球木材貿易網數據顯示，2011年6月16～30日緬甸柚木市場的4類原木離岸價都已達到3471美元·m^-3。國內市場進口柚木原木價格較高，杭州木材市場柚木價格為9000～18000元·m^-3。正是具有生長快，材質優良，用途廣和投資回報率高等特點，柚木在熱帶、南亞熱帶地區廣為種植，是世界上人工林種植面積最大的4個樹種之一，也是單位面積產值最高的造林樹種。

我國引進柚木栽培已有180多年的歷史，20世紀70年代初我國開始了柚木遺傳改良和培育技術的系統研究，為我國發展柚木事業提供了栽培材料和技術的保障。目前，我國柚木推廣種植范圍遍及10個省（自治區）60多個縣（市），總面積約1.5萬hm²。近年來，云南省、海南省把柚木列為主要造林樹種，廣東、廣西、福建、貴州省采用柚木造林的私人與企業也越來越多。柚木商品林種植多以組培優良無性系為主，選育出高產、優質和多抗的柚木優良新品系并加以推廣利用，提高良種化程度，是大力發展柚木種植業的前提。我國柚木研究人員經過多年的努力，已獲得了一批適合我國不同立地條件和氣候的柚木優良無性系，授權指定了個別組培單位進行生產繁殖和推廣。

但是，目前市場上出售的柚木苗繁殖方法多樣，繁殖材料來源不清，苗木質量良莠不齊，而現有技術憑人工經驗難以辨別出柚木不同無性系，導致我國柚木商品林發展良種使用率低，在很大程度上制約了我國柚木事業的發展。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種柚木無性系指紋圖譜的構建方法。

本發明的另一目的在于提供通過上述方法構建的柚木無性系指紋圖譜在柚木無性系品種鑒定上的應用。本發明通過研制一套柚木無性系鑒定方法，構建出我國柚木無性系指紋圖譜，為柚木無性系的鑒定和品種權保護提供技術支撐，并可有效監督和規范我國各地柚木種植苗木的良種信息情況，提高柚木商品林發展良種化程度。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種柚木無性系指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟：

（1）柚木無性系基因組DNA提取

以柚木無性系的葉片為材料，提取柚木無性系的基因組DNA，得到基因組DNA樣品；

（2）柚木無性系基因組DNA的SSR擴增

以步驟（1）中得到的基因組DNA樣品為模板，用柚木SSR多態性引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

（3）柚木無性系PCR擴增產物上測序儀分型

取步驟（2）中獲得的PCR擴增產物，加入超純甲酰胺和LIZ-500分子量內標，得到上樣液；將上樣液變性，降溫，然后進行柚木無性系SSR分型；

（4）獲得柚木無性系的指紋圖譜

用GeneMapper4.0軟件進行譜帶分析，讀取每對引物擴增出的SSR片段的大小（單位bp），得到柚木SSR多態性引物構建出的柚木無性系指紋圖譜（見表7）。

步驟（1）中所述的提取柚木無性系的基因組DNA優選采用CTAB法提取；

步驟（1）中所述的基因組DNA樣品優選是放于-20℃保存備用；

步驟（2）中所述的柚木SSR多態性引物包括15對柚木SSR多態性引物，分別是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1～30所示；