[發(fā)明專利]柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410010871.1
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103725785A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃桂華;梁坤南;周再知;馬華明
• 申請（專利權(quán)）人: 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

1.一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）柚木無性系基因組DNA提取

以柚木無性系的葉片為材料，提取柚木無性系的基因組DNA，得到基因組DNA樣品；

（2）柚木無性系基因組DNA的SSR擴增

以步驟（1）中得到的基因組DNA樣品為模板，用柚木SSR多態(tài)性引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

（3）柚木無性系PCR擴增產(chǎn)物上測序儀分型

取步驟（2）中獲得的PCR擴增產(chǎn)物，加入超純甲酰胺和LIZ-500分子量內(nèi)標，得到上樣液；將上樣液變性，降溫，然后進行柚木無性系SSR分型；

（4）獲得柚木無性系的指紋圖譜用GeneMapper4.0軟件進行譜帶分析，讀取每對引物擴增出的SSR片段的大小，得到柚木SSR多態(tài)性引物構(gòu)建出的柚木無性系指紋圖譜；

步驟（2）中所述的柚木SSR多態(tài)性引物包括15對柚木SSR多態(tài)性引物，分別是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1～30所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（1）中所述的基因組DNA樣品是放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（2）中所述的PCR擴增的反應(yīng)體系為：含濃度為25mM?Mg²⁺的10×buffer1.5μL，濃度為10mM的dNTPs0.03μL，酶活為5U/μL的Taq?DNA酶0.3μL，濃度為10ng/μL的DNA1.5μL，濃度為5μM的正向引物0.15μL，濃度為5μM的反向引物0.15μL，濃度為1nmol/μL的熒光-dUTP0.015μL，加ddH₂O至15μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（2）中所述的PCR擴增的反應(yīng)程序為：采用Touch-Down?PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、Tm+10℃至Tm℃退火30s、72℃延伸1min，20個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.5℃；94℃變性30s、Tm℃退火30s、72℃延伸1min，26個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃forever；

所述的Tm為51、53或56℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（3）中所述的上樣液的體系為：PCR擴增產(chǎn)物2μL，超純甲酰胺7.82μL，LIZ-500分子量內(nèi)標0.18μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（3）中所述的變性的條件為95℃變性5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（3）中所述的降溫是放入冰浴或4℃中進行降溫4分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟（3）中所述的進行柚木無性系SSR分型是將變性后PCR產(chǎn)物在ABI3130×1測序儀上進行柚木無性系SSR分型。

9.通過權(quán)利要求1～8任一項所述的構(gòu)建方法得到的柚木無性系指紋圖譜在柚木無性系品種鑒定上的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：利用柚木無性系指紋圖譜進行柚木品種鑒別；依據(jù)15對柚木SSR多態(tài)性引物的檢測結(jié)果進行判定：利用權(quán)利要求1～8任一項所述的構(gòu)建方法，提取未知柚木無性系的基因組DNA，進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物上測序儀分型，獲得每對引物擴增出的SSR片段的大小，若與上述柚木無性系指紋圖譜中的片段完全一致，即獲得該未知柚木無性系的品系名稱。