[發明專利]新的胚胎干細胞培養體系及胚胎干細胞建系方法

有效

• 申請號: 201410010363.3
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN104774803B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 董明珠;李英驥;閆勵
• 申請（專利權）人: 北京愛思益普生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;C12R1/91
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

本發明涉及生物技術領域、具體涉及新的胚胎干細胞培養體系以及采用本發明所述培養體系提高胚胎干細胞建系效率的方法。本發明所述培養體系包括：DMEMF12、N?2supplement、B?27supplement、β?巰基乙醇、谷氨酰胺、胰島素、牛血清白蛋白、雙抗(青霉素+鏈霉素)、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子(LIF)、Knockout Serum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y?27632、P38MAPK inhibitor和Forskolin。本發明新型的培養體系及其方法既能保證得到穩定的胚胎干細胞系，又能夠顯著性提高胚胎干細胞的建系效率，同時還能維持胚胎干細胞的多能性，使其始終處于優良的生長狀態，從而更好地推動胚胎干細胞在轉基因和疾病模型領域的廣泛應用。

技術領域

本發明涉及生物學技術領域，具體涉及新的用于胚胎干細胞的新的培養體系以及采用所述培養體系提高胚胎干細胞建系效率的方法。

背景技術

1981年，英國科學家馬丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干細胞系，開啟了胚胎干細胞領域的研究工作(Evans and Kaufman，1981)。此后，Nicholas M.Gough等發現一種被稱之為白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factors，LIF)的化合物，它能夠維持小鼠胚胎干細胞保持未分化狀態，使得小鼠ESCs能夠在體外長期穩定地傳代培養(Williams eta1.，1988)。隨著研究的愈發深入，科學家們對小鼠ESCs的多能性調控機制的研究也越來越透徹(Niwa et al.，2009)，這樣也推進了小鼠培養體系的跟進和發展。從最初的胎牛血清培養基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到應用最為廣泛的“代胎體系”，培養基的發展實現了從有血清到無血清、從成分不明確到確定化學成分的過程；而且通過培養基的不斷更新和發展，具有不同遺傳背景的小鼠品系，如C57BL／6、DBA2、CBA、NOD等，均在體外成功地得到了ESC細胞系，這對于疾病模型的建立、轉基因及胚學研究都具有重要意義。

然而，具有不同遺傳背景的小鼠胚胎體外建立ESCs細胞系的能力是不一樣的(Hanna et al.，2009)。遠交封閉群來源的ESCs體外建系能力是最容易的，如129Sv、CD-1等，利用傳統的胎牛血清培養體系，就可以高效率建立ESCs細胞系，但是近交品系來源的小鼠ESCs在此培養條件下建系則十分困難，如C57BL／6、NOD等，其建系效率幾乎為零。隨著KoSR血清替代品的出現，近交系小鼠ESCs的建系效率得到了極大的提高，但是其不同細胞系的生長狀態差異較大，不是特別穩定。

Evans，M.J等人(′Establishment in culture of pluripotential cellsfrommouse embryos′，Nature(1981)292(5819)：154-6；Williams，R.L.等人(′Myeloidleukaemia inhibitoryfactor maintains the developmental potential of embryonicstem cells′，Nature(1988)336(6200)：684-7)公開了“FBS(15％)的培養體系，但是該體系只限于特殊背景(如封閉群品系小鼠)的胚胎干細胞建系，而對于其他背景(如近交系小鼠)的胚胎干細胞建系則無法實現，且在“FBS(15％)”體系內，胚胎干細胞的生長狀態一般，克隆集落相對較小。