[發明專利]新的胚胎干細胞培養體系及胚胎干細胞建系方法

有效

• 申請號: 201410010363.3
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN104774803B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 董明珠;李英驥;閆勵
• 申請（專利權）人: 北京愛思益普生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;C12R1/91
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

1.一種胚胎干細胞培養體系，其特征在于，所述培養體系包括：DMEMF12、N-2Supplement、B-27 Supplement、β-巰基乙醇、谷氨酰胺、胰島素、牛血清白蛋白、青霉素+鏈霉素的雙抗、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子、Knockout Serum Replacement、P53inhibitor、Y-27632、P38 MAPK inhibitor和Forskolin；其中，所述培養體系以總溶液為計算基礎，其中DMEMF12為90％～97％；N-2 Supplement為1:50～1:200；B-27 Supplement為1:25～1:100；β-巰基乙醇為0.05～0.2mM；谷氨酰胺為1mM～5mM；胰島素為10μg/mL～50μg/mL；牛血清白蛋白為0.001％～0.005％；青霉素+鏈霉素的雙抗為1：50～1：100；Pd0325901為0.8μM～2μM；Chir99021為3μM～10μM；白血病抑制因子為1000U/mL～10000U/mL；Knockout Serum Replacement為3％～10％；P53 inhibitor為2μM～50μM；Y-27632為5μM～10μM；P38 MAPK inhibitor為5μM～20μM；和Forskolin為10μM～20μM。

2.根據權利要求1所述的培養體系，其特征在于，所述培養體系為：DMEMF12為92％～96％；N-2 Supplement為1：80～1：120；B-27Supplement為1：25～1：75；β-巰基乙醇為0.07mM～0.15mM；谷氨酰胺為2mM～4mM；胰島素為10μg/mL-30μg/mL；牛血清白蛋白為0.002％～0.004％；青霉素+鏈霉素的雙抗為1：70～1：100；Pd0325901為0.8μM～1.5μM；Chir99021為3μM～6μM；白血病抑制因子為1000U/mL～6000U/mL；Knockout SerumReplacement為3％～8％；P53 inhibitor為2μM～10μM；Y-27632為5μM～8μM；P38 MAPKinhibitor為5μM-8μM；和Forskolin為10μM～15μM。

3.根據權利要求2所述的培養體系，其特征在于，所述培養體系為：

4.一種用于小鼠、大鼠或兔子胚胎干細胞系的建系方法，其特征在于，所述方法包括：

1)取囊胚，接種在鋪有飼養層的孔板內，放置在37℃、5％CO₂的培養箱內，用權利要求1-3任一所述的培養體系進行孵育培養；

2)培養至囊胚貼壁后形成生長暈，用口吸管調取生長暈，放置在事先37℃預熱的0.25％胰酶滴中，37℃消化；然后用口吸管將生長暈吸出，并直接吹入到含有權利要求1-3任一所述培養體系的新孔內并吹散生長暈，放置于37℃、5％CO₂的培養箱內繼續培養，記為P1代；

3)培養至克隆集落長大后，棄上清液，用0.25％的胰酶消化整個孔；然后用含10％的血清的培養液終止胰酶消化，并反復吹吸；之后將細胞和液體統一轉移到離心管內，離心；

4)離心完畢后，棄上清，用培養液重懸沉淀，并按照合適的比例將細胞接種在新的培養皿內，記為P2代；

5)重復3)和4)步驟，直至形成穩定的胚胎干細胞系。