[發明專利]一種獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的方法

在審

• 申請號: 201410010130.3
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN103773778A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 王澍;樊國盛;段曉梅;彭建松;林開文;區智
• 申請（專利權）人: 西南林業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的方法。

背景技術

目前，一些竹類植物具有一定的耐鹽性。了解竹類植物的抗鹽機理，克隆抗鹽基因并轉移到鹽敏感的植物中，培育抗鹽的轉基因作物新品種，對于竹類植物作為濱海地區防護林來說，具有十分重要的意義。

質膜型Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白負責Na⁺的外排，將細胞質中的Na⁺逆向運送到胞外高Na⁺環境中，保持細胞中Na⁺的平衡，防止Na⁺對細胞質中細胞器的傷害。植物中Na⁺/H⁺antiporter最早發現是在大麥質膜上，此在大麥質膜上首次發現后，一些植物的質膜型Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因都已被克隆和鑒定，其中包括水稻SOS1、擬南芥AtSOS1、小麥TaSOS1、大葉補血草LgSOS1、番茄LeSOS1等。同時，轉SOS1基因能提高轉基因植株擬南芥的耐鹽性。

耐鹽植物在形成了各種潛在抗鹽機制，而一些竹類植物具有一定的耐鹽性包括剛竹、白哺雞竹、早竹、紅竹、淡竹等，其相關耐鹽基因在耐鹽品種的抗鹽機制中起到關鍵作用。

云南竹類資源最為豐富，中華大節竹(Indosasa?sinica)在云南河口天然竹林的面積約為8580多公頃，開發潛力很大。中華大節竹具有一定的耐鹽性，產于貴州南部，云南南部和東南部、廣西多生于低海拔地區。葉片通常為帶狀披針形。但對中華大節竹的耐鹽機制尚未從分子水平加以研究。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的方法，旨在解決現有缺少中華大節竹的耐鹽機制從分子水平研究的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的方法，該獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的方法包括以下步驟：

步驟一，提取中華大節竹幼苗的根、莖和葉的總RNA，混合RNA后，反轉錄合成第1鏈cDNA；

步驟二，用擬南芥和水稻等模式植物的SOS1基因序列，根據保守區域的序列設計簡并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1，以反轉錄合成第1鏈cDNA為模板，進行PCR擴增；

步驟三，PCR加樣總體系為50μL：cDNA模板為1.0μL，上和下游引物10μmol/L分別為1μL，10×Buffer?Mg2⁺為5μL，dNTPs?Mixture10mmol/L為4μL，ExTaq?DNA聚合酶5U/μL為0.5μL，最后補37.5μL的滅菌水；通過PCR的擴增，獲得了700bp的中間片段；

步驟四，利用SMARTTM?RACE?cDNA?Amplification?Kit試劑盒中已知的引物，根據中間片段設計特異引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分別進行3′RACE和5′RACE的擴增，通過巢式PCR分別獲得3′和5′片段；

步驟五，用Vector?NTI12軟件拼接中間、3′和5′片段，拼接出IsSOS1基因全長cDNA序列，根據拼接出的全長序列，設計特異引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2通過PCR擴增，PCR擴增后獲得含有IsSOS1基因全長編碼框的cDNA序列。

進一步，cDNA序列包含3105bp的開放閱讀框，同時編碼1035個氨基酸殘基，序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。

進一步，該獲得中華大節竹SOS1逆向轉運蛋白編碼基因序列的全長為3516bp，開放讀碼框為3105bp，編碼了1035個氨基酸多肽。