[發(fā)明專利]一種獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410010130.3
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN103773778A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王澍;樊國盛;段曉梅;彭建松;林開文;區(qū)智
• 申請（專利權(quán)）人: 西南林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，該獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的方法包括以下步驟：

步驟一，提取中華大節(jié)竹幼苗的根、莖和葉的總RNA，混合RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA；

步驟二，用擬南芥和水稻等模式植物的SOS1基因序列，根據(jù)保守區(qū)域的序列設(shè)計簡并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1，以反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟三，PCR加樣總體系為50μL：cDNA模板為1.0μL，上和下游引物10μmol/L分別為1μL，10×Buffer?Mg2⁺為5μL，dNTPs?Mixture10mmol/L為4μL，ExTaq?DNA聚合酶5U/μL為0.5μL，最后補37.5μL的滅菌水；通過PCR的擴(kuò)增，獲得了700bp的中間片段；

步驟四，利用SMARTTM?RACE?cDNA?Amplification?Kit試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計特異引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得3′和5′片段；

步驟五，用Vector?NTI12軟件拼接中間、3′和5′片段，拼接出IsSOS1基因全長cDNA序列，根據(jù)拼接出的全長序列，設(shè)計特異引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2通過PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后獲得含有IsSOS1基因全長編碼框的cDNA序列。

2.如權(quán)利要求1所述的獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，在cDNA序列包含3105bp的開放閱讀框，同時編碼1035個氨基酸殘基，序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。

3.如權(quán)利要求1所述的獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，該獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因序列的全長為3516bp，開放讀碼框為3105bp，編碼了1035個氨基酸多肽。