[發(fā)明專(zhuān)利]用于艾美爾屬球蟲(chóng)病毒的簡(jiǎn)并引物RT-PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410009964.2
• 申請(qǐng)日: 2014-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103898237B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建華;武斌;張西臣;宮鵬濤;信彩巖;張國(guó)才;楊舉;李赫;楊正濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種用于非疾病診斷和治療目的的艾美爾屬球蟲(chóng)病毒的簡(jiǎn)并引物RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1）在STE緩沖液的條件下，使用苯酚氯仿對(duì)經(jīng)過(guò)液氮研磨的球蟲(chóng)材料進(jìn)行抽提，獲取總核酸，總核酸中的DNA經(jīng)由DNaseI消化處理，獲取RNA的粗提產(chǎn)物，即為待檢核酸樣品；

2）該待檢核酸樣品直接作為模板，使用PrimeScript? Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）；因?yàn)榍蛳x(chóng)病毒基因組為dsRNA，所以反轉(zhuǎn)錄使用CF和CR兩條簡(jiǎn)并引物同時(shí)進(jìn)行；

上游引物：CF：5’-CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’；

下游引物：CR：5’-GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’；

以上CF引物使用了I（次黃嘌呤），代替N（N=A/T/C/G）；

其中兼并堿基代碼：R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T；

3）經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA使用TaKaRa LA Taq 核酸聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增為dsDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。