[發(fā)明專利]用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410009964.2
• 申請(qǐng)日: 2014-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN103898237B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建華;武斌;張西臣;宮鵬濤;信彩巖;張國才;楊舉;李赫;楊正濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發(fā)明公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT?PCR檢測方法，提供了一對(duì)全新的簡并引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和降落PCR技術(shù)對(duì)艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行特異性的簡并引物RT?PCR擴(kuò)增。本發(fā)明簡并引物RT?PCR方法可有效檢測柔嫩艾美爾球蟲病毒和斯氏艾美爾球蟲病毒存在，并且專一性好(電泳條帶單一)。為首次用于艾美爾屬球蟲病毒檢測的方法，可以快速準(zhǔn)確的識(shí)別待檢球蟲樣本中是否含有攜病毒的蟲株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，提供了一對(duì)全新的簡并引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和降落PCR技術(shù)對(duì)艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行特異性的簡并引物RT-PCR擴(kuò)增。所應(yīng)用的技術(shù)為簡并引物設(shè)計(jì)、反轉(zhuǎn)錄、降落PCR（TD-PCR），屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

雞球蟲病 （Coccidiosis）是由一種或多種艾美爾屬球蟲引起，且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病。作為一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，艾美爾球蟲導(dǎo)致全球養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失，每年大約80億美元的損失。雙鏈RNA病毒首先在真菌中于1948年發(fā)現(xiàn)，此后又在原蟲中發(fā)現(xiàn)了dsRNA病毒。原蟲病毒是一類存在于原蟲體內(nèi)的病毒粒子，大多為雙鏈RNA（dsRNA）病毒，球形20面體，直徑30-50nm，具有RNA依賴RNA聚合酶活性。在球蟲病毒研究方面，已報(bào)道在柔嫩艾美爾球蟲、斯氏艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、布氏艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲以及堆型艾美爾球蟲內(nèi)存在病毒樣粒子或病毒樣核酸。但目前關(guān)于球蟲病毒的許多特性尚不十分清楚。

在艾美爾球蟲的研究中，發(fā)現(xiàn)球蟲的致病力與其是否攜帶病毒存在相關(guān)性。目前對(duì)于艾美爾球蟲病毒研究剛剛起步，大量的研究還集中在對(duì)病毒樣粒子的電鏡觀察。目前對(duì)球蟲病毒的檢測方法尚無標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的方法是電鏡觀察病毒樣粒子的存在，然而此方法成本高，而且檢出率低。另一種方法是檢測病毒核酸，但由于自然感染病例往往是混合感染，攜帶病毒的蟲株比例低，特別是在有其他生物材料污染的情況下其檢測的靈敏度非常低，而且誤檢率高，對(duì)結(jié)果的判斷沒有具體標(biāo)準(zhǔn)。因此開發(fā)一種靈敏的、準(zhǔn)確的、成本低以及對(duì)所有艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行通用性檢測的方法，是非常有必要的。

簡并引物PCR是因?yàn)檫z傳密碼具有簡并性，大部分的氨基酸都有不止一個(gè)密碼子來編碼，而且同源同工蛋白往往在一些重要區(qū)段具有較高的氨基酸序列保守性，所以對(duì)未知目的基因可以通過已知的多個(gè)同源同工基因的保守區(qū)大概推測，并以此設(shè)計(jì)具有簡并位點(diǎn)的簡并引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。簡并引物PCR因此具有同源同工基因擴(kuò)增的一定的通用性。簡并引物的設(shè)計(jì)是簡并引物PCR成功與否的關(guān)鍵步驟。要獲得可供檢測的目的核酸片段，必須使用RT-PCR的方法將RNA擴(kuò)增為DNA。傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)針對(duì)ssRNA采用單一的下游引物進(jìn)行。目前尚無用于檢測艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT –PCR檢測方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，為簡并引物RT-PCR檢測方法，解決了目前尚無檢測艾美爾球蟲屬病毒方法的難題，該方法應(yīng)用高保守區(qū)域的低變異特性，使用簡并引物對(duì)艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行檢測，達(dá)到特異性與通用性相結(jié)合，為檢測艾美耳屬球蟲病毒提供了新的可行的辦法。

包括以下步驟：

1）在STE緩沖液的條件下，使用苯酚氯仿對(duì)經(jīng)過液氮研磨的球蟲材料進(jìn)行抽提，獲取總核酸，總核酸中的DNA經(jīng)由DNaseI消化處理，獲取RNA的粗提產(chǎn)物；

2）該粗提產(chǎn)物直接作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT），因?yàn)榍蛳x病毒基因組為dsRNA，所以反轉(zhuǎn)錄使用CF和CR兩條簡并引物同時(shí)進(jìn)行；

上游引物：CF：5’-CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’

下游引物：CR：5’-GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’

以上CF引物使用了I（次黃嘌呤），代替N（N=A/T/C/G）；

其中兼并堿基代碼：