[發明專利]一種蟾蜍二烯內酯類化合物選擇性分離純化方法

無效

• 申請號: 201410009557.1
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN104774234A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 李曉龍;梁鑫淼;劉艷芳;張云;張秀莉;薛興亞
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07J41/00
• 分類號: C07J41/00;C07J71/00;C07J19/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種蟾蜍二烯內酯類化合物選擇性分離的純化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮乙醇提取物先經制備型RPLC分離，水（A）和甲醇（B）流動相體系；洗脫梯度為體積濃度25%→100%B（V/V）；按各色譜峰的保留時間分別收集各餾分，每個組分濃縮至干后備用；

2）針對富含蟾蜍二烯內酯的組分F13，分離過程中F13組分對應的流動相中甲醇的體積濃度為57%-58.3%，采用半制備反相色譜進行進純化制備，色譜柱為XCharge?C18柱；采用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流動相體系，對F13進行選擇性地分離和化合物制備。

2.按照權利要求1所述蟾蜍二烯內酯分離純化方法，其特征在于：反相色譜柱為極性共聚的帶正電荷的混合模式柱（XCharge?C18）；采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式，對氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物進行選擇性分離和純化。

3.按照權利要求1所述蟾蜍二烯內酯分離純化方法，其特征在于：色譜操作參數如下：色譜柱內徑為4.6-100mm；采用體積濃度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上樣濃度為1mg/mL^-1-1g/mL；進樣量為1μL-40mL；流速為1-480mL/min；柱溫為10-60℃。

4.按照權利要求1所述蟾蜍二烯內酯分離純化方法，其特征在于：所述流動相中酸可以是以下酸中的一種或二種以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理，所述酸水溶液中酸的體積濃度為0.1%-0.5%（V/V）。

5.按照權利要求1所述蟾蜍二烯內酯分離純化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物為50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

6.按照權利要求1所述蟾蜍二烯內酯分離純化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先經制備型RPLC分離，色譜條件：色譜柱為碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流動相體系；洗脫梯度為0-7min,體積濃度25%→40%B;7-60min,體積濃度40%→65%B;60-65min,體積濃度65%→100%B;65-75min,100%B；流速為330mL/min；檢測波長為300nm；其采用體積濃度65%-80%甲醇-水溶解，樣品溶液濃度為440mg/mL；進樣體積為40mL；按各色譜峰的保留時間分別收集各餾分，共計22個組分，每個組分濃縮至干后備用；針對F13（分離過程中F13組分對應的流動相中甲醇的體積濃度為57%-58.3%），采用半制備反相色譜進行進純化制備，色譜柱為XCharge?C18柱；采用乙腈-酸水流動相體系，采用線性梯度洗脫方式制備蟾蜍二烯內酯單體化合物；

2）選取組分F13采用半制備反相色譜進行進一步分離，色譜條件：色譜柱為帶正電荷的混合模式色譜柱（XCharge?C18,250×20mm,i.d.,5μm）；體積濃度0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）流動相體系；流速為19mL/min；檢測波長為300nm；進樣量為2mL；按各色譜峰的保留時間分別收集各餾分，分別回收溶劑，經核磁實驗確定，獲得1,2,3,4,5,6,7,8八個化合物；

通過反相色譜制備獲得兩類八個高純度蟾蜍二烯內酯化合物；所述兩類化合物分別為4個氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物：化合物1為異沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2為去乙酰華蟾毒它靈-3-庚二酰精氨酸酯，化合物3為沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物4為遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯；4個非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯：化合物5為遠華蟾毒精，化合物6為乙酰華蟾毒精，化合物7為華蟾毒它靈，化合物8為3-去氫蟾毒靈。