[發明專利]一種蟾蜍二烯內酯類化合物選擇性分離純化方法

無效

• 申請號: 201410009557.1
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN104774234A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 李曉龍;梁鑫淼;劉艷芳;張云;張秀莉;薛興亞
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07J41/00
• 分類號: C07J41/00;C07J71/00;C07J19/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及蟾蜍二烯內酯類化合物的分離純化，具體地說是一種反相色譜采用帶正電荷的XCharge?C18柱在低pH條件下高選擇性地分離純化蟾蜍二烯內酯類化合物的新方法。該方法對氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物表現出較優的分離效果。

背景技術

蟾蜍二烯內酯（bufadienolides）是一類C24甾，并且在甾體母核的C17位接有β六元不飽和內酯環，該類化合物也常被稱為蟾蜍二烯內酯。Liselotte.Krenn,Pieter?S.Steyn和高慧敏等分別對蟾蜍二烯內酯合物具有的生物活性進行了綜述。這些活性主要包括局麻、強心、升壓、Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性及抗腫瘤等作用（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides?from?animal?and?plant?sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.；P.S.Steyn,Fanie?R.van?Heerden,Bufadienolides?of?plant?and?animal?origin,Nat.Prod.Rep,15(1998)397-413.；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolides?and?their?antitumor?activity,Nat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.）。另外，此類蟾蜍二烯內類成分中的許多化合物都具有較高的毒性和較嚴重的副作用，從而制約了此類制劑的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,Chemical?Constituents?and?Bioactivities?of?the?Skin?of?Bufo?bufo?gargarizans?Cantor,Chem.Biodivers.,8(2011)559-567.）。并對使用者帶來一定的安全隱患。從天然產物（蟾蜍皮、蟾酥）中分離純化是獲得蟾蜍二烯內酯單體的主要途徑。由于蟾蜍二烯內酯類化合物數量多、結構復雜，常規的分離純化方法較為耗時、低效(L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides?from?animal?and?plant?sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.)。然而，由于此類化合物的本身的結構復雜性和數目的繁多，關于此類化合物的藥效理，目前的認識還是遠遠不夠的。因此，采用較為系統的高效的方法從蟾蜍皮中分離出高純度的蟾蜍二烯內酯類化合進而開展相關藥理毒理方面的研究是十分迫切的。

發明內容

本發明涉及一種蟾蜍二烯內酯類化合物選擇性分離純化方法。

基于低pH值條件下，氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯類化合物的離子性質的不同，我們采用帶正電荷的XCharge?C18柱發展了一種新型的高選擇性的高效液相色譜法。流動相組成為乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。其中所述的帶正電荷的柱子為混合模式柱（XCharge?C18，北京華譜新創科技有限公司）。色譜操作參數如下：色譜柱內徑為4.6-100mm；樣品濃度為1mg/mL^-1-1g/mL；進樣量為1μL-40mL；流速為1-480mL/min；柱溫為10-60℃。所述流動相組成為乙腈-酸-水、甲醇-酸-水、乙醇-酸-水；其中酸可以是以下酸中的一種或幾種：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸。在該純化體系中從蟾蜍皮提取物中制備獲得兩組八個蟾蜍二烯內酯化合物。所述化合物的結構信息見式1、表1。

式1氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯（1-4）和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內酯（5-8）的結構式

表1純化制得的8個蟾蜍二烯內酯類化合物信息

一種蟾蜍二烯內酯類化合物選擇性分離的純化方法，

1）蟾蜍皮乙醇提取物先經制備型RPLC分離，水（A）和甲醇（B）流動相體系；洗脫梯度為體積濃度25%→100%B（V/V）；按各色譜峰的保留時間分別收集各餾分，每個組分濃縮至干后備用；

2）針對富含蟾蜍二烯內酯的組分F13，分離過程中F13組分對應的流動相中甲醇的體積濃度為57%-58.3%，采用半制備反相色譜進行進純化制備，色譜柱為XCharge?C18柱；采用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流動相體系，對F13進行選擇性地分離和化合物制備。