[發明專利]貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法

有效

• 申請號: 201410009128.4
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103713035A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 郭萌萌;譚志軍;吳海燕;李兆新;王聯珠;翟毓秀
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

技術領域

本發明屬于電化學檢測技術領域，具體地涉及一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法。

背景技術

大田軟海綿酸（Okadaic?acid，OA）屬多環聚醚類脂溶性貝類毒素，是海洋腹瀉性貝類毒素的主要成分。OA可通過食物鏈富集于貝類等濾食性海洋生物體內，導致消費者胃腸功能紊亂，出現腹瀉、嘔吐和腹痛等中毒癥狀。研究證實，OA及其衍生物鰭藻毒素能夠抑制蛋白磷酸酶的活性，是一類潛在的腫瘤促進因子，且呈現出發生頻率增加、分布區域擴大、危害日益嚴重的發展趨勢，已成為國際社會共同關注的重大食品和生態安全問題，也是發達國家制定監控計劃和貿易壁壘的主要目標。歐盟、德國和英國等多個國家規定雙殼貝類可食性組織中腹瀉性貝類毒素不大于160μg/kg(以OA計)，不過近期歐盟對OA的毒性進行了重新評估，認為現行限量標準不足以保護消費者安全，擬將該限量標準降低到45μg/kg。

目前，檢測大田軟海綿酸的方法有小鼠生物法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法和免疫分析法等。小鼠生物法的毒素提取過程繁瑣，需時較長（通常需24h），且易出現假陽性，檢出限偏高，重現性較差，而液相色譜和液相色譜-串聯質譜法需要價格昂貴的儀器和專業的人員操作，過程復雜，不能實現快速和現場檢測。電化學檢測法具有靈敏度高、操作簡便、快速、經濟、環保等優點，尤其是電化學免疫傳感器分析技術因干擾少，檢出限低，樣品預處理及儀器設備簡單而易實現現場檢測，可提供實時快速、簡單便攜和低成本的分析方法，但在貝類毒素的檢測上應用較少，具有自主知識產權的貝類毒素電化學檢測技術有待突破。

硫堇屬于吩噻嗪類，具有優良的電化學活性，聚硫堇相對于單體而言有強大的附著力，不易流失，比表面積大，反應活性高，催化效果好；亞甲基藍作為一種生物染料也是一種比較活潑的電子轉移體，在導電基質上具有良好電化學行為，其導電聚合膜具有良好的電化學活性和電催化性能。目前，聚硫堇和聚亞甲基藍作為高性能的電子交換聚合物已被廣泛用作直接電化學電極的功能基質膜和電子媒介體，但鮮有聚硫堇-亞甲基藍復合電聚合膜用于非標記型電化學免疫傳感器的構建。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，以克服現有檢測貝類毒素大田軟海綿酸技術上的不足，如儀器復雜、昂貴、步驟繁瑣等缺點。本發明在金電極表面通過循環伏安法電聚合一層聚硫堇-亞甲基藍復合膜，并借助納米金的導電性、生物相容性與高比表面的特性實現抗體的有效固定，利用具有特殊分子結構的OA與其抗體特異性結合生成以陰離子形式存在的免疫產物，能阻礙電極表面電子傳遞的特性，構建了一種非標記型電化學免疫傳感器，結合電化學工作站，實現了對貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的:

一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，包括以下步驟:

（1）金電極的預處理：金電極打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡，在稀H₂SO₄溶液中于-1.0～1.55V電位下循環掃描，取出后用水沖洗，吹干；

（2）傳感器的制備：將步驟（2）處理后的金電極置于含有終濃度為1mmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍、0.1mol/L氯化鉀和pH6.010mmol/L?PBS緩沖液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置，然后用循環伏安法掃描，形成硫堇-亞甲基藍復合聚合膜；用水充分淋洗金電極后，將其浸于納米金溶液中，以在金電極上獲得納米金層；取大田軟海綿酸單克隆抗體涂覆在金電極表面，室溫下反應；滴加牛血清白蛋白（BSA）溶液以覆蓋多余的非特異性位點，即完成傳感器的制備；

（3）大田軟海綿酸的測定：將不同濃度梯度的OA標準溶液或樣品溶液滴加到步驟（2）所制備的傳感器表面，反應后，使用電化學工作站進行差示脈沖伏安測量，記錄免疫反應前后峰電流值。

進一步，步驟（2）所述的納米金溶液的合成方法為：取HAuCl₄溶液加熱煮沸，在攪拌回流狀態下迅速加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續煮沸，待溶液顏色變為深酒紅時，即完成納米金的合成，其中HAuCl₄與檸檬酸三鈉的質量比為1：3。

進一步，所述的HAuCl₄溶液和檸檬酸三鈉的濃度分別為0.01%（重量比）、1%（重量比）。

進一步，步驟（3）所述的樣品溶液的獲取方法：稱取貝樣，加入甲醇水溶液均質提取，離心后定容；取提取液用氮氣吹干，用PBS緩沖溶液定容，超聲波震使蕩殘留物充分溶解，溶解液過濾膜后待測。