[發(fā)明專利]一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410009116.1
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103740824A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖鵬峰;浦丹
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32;C12R1/33
• 代理公司: 江蘇永衡昭輝律師事務(wù)所 32250
• 代理人: 王斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種實(shí)現(xiàn)微生物種群鑒定的方法，具體涉及一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物的鑒定在疾病預(yù)防和治療方面有廣泛的應(yīng)用。快速、準(zhǔn)確地檢測微生物在疾病傳染和抗菌治療中有重要的作用，尤其是少量致病微生物的檢測。例如，近年來肺結(jié)核疾病治療中抗藥株給治療帶來很大的困難，需要對菌株進(jìn)行有效的鑒定，以便采取個(gè)體化用藥的針對性治療。常用的手段是將微生物系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子（phylogenetic?markers）可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。目前，基于系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子的微生物鑒定方法普遍用于微生物的分離和鑒定。這些系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子有16s?rRNA、18s?rRNA、rnpB、ropB、gyrB基因等。這些系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子普遍存在于微生物中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它們適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究?；赑CR擴(kuò)增系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子序列來鑒定微生物種群的方法主要有Sanger測序，焦磷酸測序，Real-TimePCR、PCR-DGGE（Denaturing?Gradient?Gel?Electrophoresis）、PCR-RFLP（restriction?fragment?length?polymorphism）等。其中，最準(zhǔn)確的方法為Sanger測序、焦磷酸測序，即是將PCR產(chǎn)物的序列的堿基信息完全測定，然后與菌株的特征序列的堿基信息進(jìn)行比對來確定，這些將特征序列的堿基信息完全確認(rèn)的測序方法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。然而，Sanger測序受特定設(shè)備的限制，需要到指定的場所進(jìn)行測定，使得時(shí)間上受限。相對而言，焦磷酸測序需要的儀器價(jià)格便宜，簡易的焦測序儀甚至可以方便攜帶于現(xiàn)場進(jìn)行分析。傳統(tǒng)的焦磷酸測序方法通過每次加入一種核苷酸進(jìn)行實(shí)時(shí)合成測序。每次測序反應(yīng)都能得到堿基的具體信息。通過測序得到系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子的序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的菌株序列比對，鑒定具體的菌株。但是，對于傳統(tǒng)的焦測序平臺(tái)用于這些特定PCR產(chǎn)物的序列分析而言，在DNA模板量少，以及老舊的傳統(tǒng)焦測序儀器上，要準(zhǔn)確獲取長度約為50bp的序列信息不僅費(fèi)時(shí)，而且往往很難。所以，需要提出一種有效分離和鑒定微量微生物種群的方法。

本實(shí)驗(yàn)室提出一種基于兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測序的方法（ZL201210128597.9），該方法通過同時(shí)加入未標(biāo)記的兩種dNPTs實(shí)時(shí)測序，得到一組編碼。該方法中兩核苷酸測序方式可以有三種方式：AG/CT，AC/GT，AT/CG。采用該方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，要么將PCR產(chǎn)物分為兩份，要么對PCR產(chǎn)物焦測序之后再進(jìn)行變性。前者，對PCR產(chǎn)物樣本的需求量大，不利于微量模板的檢測和鑒定。后者，產(chǎn)物變性會(huì)相應(yīng)的增加測序步驟和測序時(shí)間，降低測序效率。但是，通過兩核苷酸同時(shí)加入到測序反應(yīng)中，相同模板濃度的情況下，測序得到的峰譜信號比傳統(tǒng)焦測序的峰譜信號強(qiáng)，即峰高更高。這一特點(diǎn)有利于檢測微量樣本。另外，通過兩核苷酸同時(shí)加入到測序反應(yīng)中，模板所需的測序反應(yīng)次數(shù)會(huì)相應(yīng)的減少，且不同模板在不同的測序方式下得到的峰譜信息不同，以及每次反應(yīng)得到的峰譜信號強(qiáng)度也不同。所以，可以通過比較模板測序反應(yīng)次數(shù)以及每次反應(yīng)得到的峰譜信號強(qiáng)度來鑒定微生物。所以，我們提出一種基于兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測序圖譜鑒定微生物的方法。

本發(fā)明的目的是提供一種微量微生物鑒定的方法。通過兩核苷酸同時(shí)加入到測序反應(yīng)中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，不同模板所需的測序反應(yīng)次數(shù)不同，且在不同的測序方式下得到的測序反應(yīng)峰譜信號強(qiáng)度不同。通過這一原理可實(shí)現(xiàn)微生物菌群的鑒定。該方法能有效提高微生物鑒定的靈敏度、縮短操作時(shí)間、為微生物的分離和鑒定提供一種可靠的選擇。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測序圖譜實(shí)現(xiàn)微生物種群鑒定的方法。本發(fā)明為微生物種群的分類和鑒定提供了一種可行的檢測方法，有助于簡化微生物種群的鑒定。