[發(fā)明專利]建立iPS的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410008450.5
• 申請日: 2014-01-02
• 公開（公告）號(hào): CN103756969A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程濤;李彥欣;劉淑萍;許靜;顧?；?/a>;袁衛(wèi)平;張孝兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10
• 代理公司: 天津?yàn)I?？凭曋R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種建立iPS細(xì)胞的方法，特別涉及一種在無插入的基礎(chǔ)上建立了無FBS，無Feeder無動(dòng)物源的人iPS的方法。?

背景技術(shù)

2006年，日本科學(xué)家Yamanaka的研究組將4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞”(induced?pluripotent?stem?cells,iPS細(xì)胞)^[1]。2007年，Yamanaka博士?^[2]和美國Thomson博士研究組^[3]分別用特定的因子誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞，也使之成為了iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功是干細(xì)胞研究乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑，它首次證明：可以用已知的幾種因子在體外逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分化的細(xì)胞，使之成為全新的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，這項(xiàng)技術(shù)避免了干細(xì)胞研究領(lǐng)域的免疫排斥和倫理道德問題。?

盡管近年來iPS技術(shù)不斷取得發(fā)展，各種改良技術(shù)時(shí)有出現(xiàn)。然而重編程效率低下一直都是科學(xué)家們頭疼的問題，成為了iPS臨床轉(zhuǎn)化的重要障礙之一。經(jīng)典的利用病毒為載體將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入分化細(xì)胞的方法，很可能導(dǎo)致外源基因插入細(xì)胞的基因組中,引起插入突變,存在很大的弊端，iPS細(xì)胞的致瘤性影響其在再生醫(yī)學(xué)和臨床細(xì)胞治療中的應(yīng)用^[4]。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc本身就是一種原癌基因。解析體細(xì)胞重編程過程中的分子調(diào)控機(jī)制，開發(fā)出高效安全的iPS技術(shù)成為了近年來干細(xì)胞領(lǐng)域研究人員的熱點(diǎn)。?

供體細(xì)胞類型影響iPS細(xì)胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究組嘗試?yán)眯∈笪负透蔚募?xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)由胃和肝細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞^[5]。采集皮膚細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞需要六七十天時(shí)間，而從血液采集細(xì)胞制備iPS細(xì)胞只需3周左右，而且人外周血細(xì)胞來源豐富，采集方法便利，創(chuàng)傷性小，安全性好。人外周血細(xì)胞是當(dāng)前最理想的供體細(xì)胞之一，具有安全、方便、數(shù)量多等優(yōu)勢^[6]。?

使用病毒載體轉(zhuǎn)染外源基因制備iPS細(xì)胞不僅操作過程復(fù)雜、對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和管理要求嚴(yán)格，而且細(xì)胞有可能引發(fā)腫瘤的形成，這就阻礙了iPS細(xì)胞技術(shù)的普及和在臨床應(yīng)用的推廣。當(dāng)前應(yīng)用基因非整合方法建立iPS細(xì)胞主要有以下幾個(gè)方面1）腺病毒載體，2）質(zhì)?；蛘?minicircle?DNA，3）蛋白直接導(dǎo)入，但是這三種方法重建效率均非常低，難以滿足基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)需要和臨床應(yīng)用研究。仙臺(tái)病毒^[7]及改良mRNA方法^[8]建立非整合iPS細(xì)胞的效率很高，但是費(fèi)用相當(dāng)高，不適用于大規(guī)模臨床治療的開展。Episomal?Vectors是目前最高效最經(jīng)濟(jì)的基因非整合建立iPS細(xì)胞的方法^[9]。?

2013年5月張孝兵教授^[10]應(yīng)用改良的表達(dá)Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc的EV成功地將人外周血單個(gè)核細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，重編程效率顯著高于以往實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)。?

雖然我們利用episomal技術(shù)可以獲得沒有外源基因插入的iPS技術(shù)。解決了因?yàn)橥庠椿虻牟迦耄T導(dǎo)基因組不穩(wěn)定和成瘤性的危險(xiǎn)，大大促進(jìn)了iPS技術(shù)臨床應(yīng)用的可能性。但在體外培養(yǎng)細(xì)胞Feeder細(xì)胞以及處理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS，這些可能會(huì)造成免疫和異源病毒或蛋白造成的疾病的產(chǎn)生，增加疾病治療的風(fēng)險(xiǎn)，而且增加了IPS的使用成本，不適合廣泛的、大規(guī)模的臨床應(yīng)用，研究在無插入外源基因建立IPS的技術(shù)基礎(chǔ)上，無添加FBS、Feeder建立IPS的方法，具有重要的臨床價(jià)值。在發(fā)明中，我們在無插入的基礎(chǔ)上建立了無FBS，無Feeder無動(dòng)物源的iPS建立技術(shù)。使iPS技術(shù)更符合臨床應(yīng)用的需求。?

[1]Takahashi?K,Yamanaka?S.Induction?of?pluripotent?stem?cells?from?mouse?embryonic?and?adult?fibroblast?cultures?by?defined?factors.Cell.2006;126:663--76.?