[發(fā)明專(zhuān)利]建立iPS的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410008450.5
• 申請(qǐng)日: 2014-01-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103756969A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程濤;李彥欣;劉淑萍;許靜;顧?；?/a>;袁衛(wèi)平;張孝兵
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 代理公司: 天津?yàn)I?？凭曋R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

1.一種建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步驟：利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞，紅系培養(yǎng)方法（無(wú)血清）培養(yǎng)8天，將episomal的三個(gè)質(zhì)粒：pEV?SFFV-OS(OS)，pEV?SFFV-MK(MK)，pEV?SFFV-B(B)電轉(zhuǎn)到單核細(xì)胞中，之后用vitrinectin（人源蛋白）處理的板子上培養(yǎng)，利用E6培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15天后會(huì)看到克隆，20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代到10后鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立iPS的方法，其特征在于：所述的紅系培養(yǎng)方法所使用的紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在SFM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加如下組分：SCF終濃度100ng/ml,IL-3終濃度10ng/ml,EPO終濃度2U/ml，IGF-1終濃度40ng/ml，地塞米松終濃度1μM，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度100μg/ml。

其中Serum?free?medium(SFM)組成為：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步驟：

利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞，紅系培養(yǎng)方法（無(wú)血清）培養(yǎng)8天，利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀(Amaxa?Nucleofector^TM)進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染，單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)8天后，計(jì)數(shù)，1x10⁶細(xì)胞加入100μl配置好的電轉(zhuǎn)緩沖液（包含不同組合質(zhì)粒如5ug?pEV?SFFV-OS(OS)+2.5ug?pEV?SFFV-MK(MK)+2.5ug?pEV?SFFV-B(B)），混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，放到電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，利用U-008轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)。將電轉(zhuǎn)后細(xì)胞種到預(yù)先人源蛋白處理的6孔板的一個(gè)孔中，應(yīng)用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)1天，加等量的hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)1天后半數(shù)換液，只加hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全換成hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)液，并隔天換液；在調(diào)單克隆之前在低氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述的低氧培養(yǎng)條件為5%O₂，5%CO₂，90%N₂；

并在培養(yǎng)基中加入0.25mM?NaB提高重編程效率，第10天停止，第12-15天開(kāi)始可見(jiàn)克隆開(kāi)始形成，第20天左右克隆逐漸成熟，通過(guò)機(jī)械傳代方法，在顯微鏡下分離克隆，切成3,4塊后吸出，轉(zhuǎn)入hESC培養(yǎng)基E8培養(yǎng)系統(tǒng)，一周后可用化學(xué)方法消化再傳代，一直傳10代，形成穩(wěn)定的iPS細(xì)胞系。