[發明專利]一種與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記及其鑒定方法和潛在應用

有效

• 申請號: 201410007416.6
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103740702A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 杜雪地;李莉;張守都;張國范
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;劉陽

技術領域

本發明屬于基因工程與遺傳育種領域，涉及一個與海灣扇貝熱耐受性性狀相關的SNP標記及其鑒定方法和潛在應用。

背景技術

海灣扇貝原產美國大西洋沿岸及墨西哥灣，有四個地理亞種，其中北方亞種和南方亞種先后引進中國。海灣扇貝北方亞種主要養殖在河北、遼寧和山東沿海（渤海海域），南方亞種主要養殖在廣東廣西沿海（北部灣海域），是我國重要的養殖貝類。高溫年份，海灣扇貝北方亞種主養區經常發生規模死亡，給養殖戶造成巨大損失。高溫被認為是引起扇貝夏季規模死亡的主要環境誘因，因此提高海灣扇貝熱耐受性具有重要的現實意義。

生物通常有三種途徑應對環境脅迫：1）分子伴侶蛋白表達上調，幫助細胞內蛋白維持正確的空間結構或錯誤折疊蛋白的重新折疊；2）細胞抗氧化系統有效平衡脅迫條件下產生的自由基，防止胞內結構被破壞；3）啟動泛素蛋白酶體系以降解結構被破壞了的蛋白，防止其聚集產生毒性。宋林生等對海灣扇貝熱休克蛋白HSP70啟動子區進行重測序鑒定出8個與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記，這些標記可能通過影響HSP70表達水平影響海灣扇貝熱耐受性，然而這種可能性尚未被證明。

本發明在利用轉錄組測序預測海量SNP標記的基礎上，利用候選基因關聯分析的方法，篩選出1個與海灣扇貝熱耐受性極顯著相關的SNP標記，發現該SNP的T等位基因比C等位基因更有利于海灣扇貝在高溫脅迫條件下存活。熒光定量PCR結果顯示，熱激情況下海灣扇貝轉錄本53308轉錄水平顯著上調，據此推測與上述SNP緊密連鎖的一種變異通過影響基因的表達影響海灣扇貝的熱耐受性。從而，上述SNP可以作為海灣扇貝熱耐受性的功能標記，用于海灣扇貝高熱耐受性品系的選育。本發明不但提供與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記，還提供簡便且具有可移植性的鑒定方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種與海灣扇貝熱耐受性性狀相關的SNP標記及其鑒定方法和潛在應用。

本發明通過以下技術方案得以實現：

一種與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記：所述與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記位于海灣扇貝轉錄本Ai-53308序列的第760個堿基處，此堿基存在T和C兩個形式；

所述海灣扇貝Ai-53308轉錄本，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，包括步驟如下：

1）提取海灣扇貝的基因組DNA，使用滅菌水或TE緩沖液稀釋到10-20ng/uL；

2）取步驟1）中所述海灣扇貝的基因組DNA為模板，利用引物F和R配制反應體系：基因組DNA1uL，通用PCR?mix5uL，引物F和R各0.2uL，滅菌雙蒸水3.6uL（若基因組DNA濃度≤5ng/uL，可加4.6uL基因組DNA而不加滅菌雙蒸水。另反應體系可同比放大）；

3）PCR擴增的反應程序為：

4）步驟3）所述的PCR反應結束后，加入飽和熒光染料Lcgreen及內標（等量混合的高溫內標和低溫內標，即兩條具有不同GC含量的雙鏈寡核苷酸，高、低溫內標終濃度分別為2.5uM）各1uL，經過95℃退火5-10min；

5）待步驟4）所述的退火后自然降溫至室溫，進行高分辨率熔解曲線分析，鑒定待測樣本中所述海灣扇貝SNP標記的基因型，具體方法為：

a）利用內標的熔解曲線對所有待測樣本的熔解曲線進行校正；

b）對校正后的所有待測樣本熔解曲線進行分群，若熔解曲線求導圖為單峰且峰值對應橫坐標溫度大于77.5℃則SNP基因型為CC，若熔解曲線求圖為單峰且峰值對應橫坐標溫度小于77.5℃則SNP基因型為TT，若熔解曲線求導后為雙峰則SNP基因型為TC；

c）判斷每個待測樣本所述海灣扇貝SNP標記基因型。

所述步驟2）中，用于鑒定所述與海灣扇貝熱耐受性性狀相關的SNP標記的正向引物為F：5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物為R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。

SNP基因型鑒定時所需的高、低內標序列，其中，

高溫內標序列為：

5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

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