[發明專利]一種與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記及其鑒定方法和潛在應用

有效

• 申請號: 201410007416.6
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103740702A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 杜雪地;李莉;張守都;張國范
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;劉陽

1.一種與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記，其特征在于：所述與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記位于海灣扇貝轉錄本Ai-53308序列的第760個堿基處，此堿基存在T和C兩個形式；

所述海灣扇貝Ai-53308轉錄本，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

2.一種如權利要求1所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

包括步驟如下：

1）提取海灣扇貝的基因組DNA，使用滅菌水或TE緩沖液稀釋到10-20ng/uL；

2）取步驟1）中所述海灣扇貝的基因組DNA為模板，利用引物F和R配制反應體系：基因組DNA1uL，通用PCR?mix5uL，引物F和R各0.2uL，滅菌雙蒸水3.6uL；所述反應體系可同比放大；

3）PCR擴增的反應程序為：

4）步驟3）所述的PCR反應結束后，加入飽和熒光染料Lcgreen及內標各1uL，經過95℃退火5-10min；

5）待步驟4）所述的退火后自然降溫至室溫，進行高分辨率熔解曲線分析，鑒定待測樣本中所述海灣扇貝SNP標記的基因型。

3.根據權利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

所述步驟2）中，用于鑒定所述與海灣扇貝熱耐受性性狀相關的SNP標記的正向引物為F：5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物為R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。

4.根據權利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

當所述基因組DNA濃度≤5ng/uL時，需加入4.6uL基因組DNA而不加滅菌雙蒸水。

5.根據權利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

所述步驟3）中，內標為等量混合的高溫內標和低溫內標，即兩條具有不同GC含量的雙鏈寡核苷酸，高、低溫內標終濃度分別為2.5uM。

6.根據權利要求5所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

所述步驟3）中，SNP基因型鑒定時所需的高、低內標序列，其中，高溫內標序列為：

5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

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3’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-5’

低溫內標序列為：

5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

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3’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-5’。

7.根據權利要求6所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的鑒定方法，其特征在于：

獲得內標的具體方法為：

1）委托公司合成四條寡核苷酸單鏈：

GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2）用滅菌雙蒸水溶解四條單鏈核苷酸使終濃度為10uM；

3）等體積混合四條單鏈核苷酸，得到高、低溫內標終濃度分別為2.5uM的內標。

8.一種如上述任一項權利要求中所述的與海灣扇貝熱耐受性相關的SNP標記的潛在應用，其特征在于：在苗種繁育前，通過非致死性取樣提取親貝基因組DNA，利用如上述任一項權利要求中所述的SNP標記及其鑒定方法判斷親貝基因型，通過棄選CC基因型親貝有效提高后代群體的熱耐受性。