[發明專利]一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201410007284.7
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN103805713A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 魏超;林家旺;魏劭
• 申請（專利權）人: 廈門安普利生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 方惠春

技術領域

本發明涉及體外診斷試劑。尤其涉及一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途。?

背景技術

人巨細胞病毒(Human?Cytomegalo?virus，HCMV)屬皰疹病毒科乙組皰疹亞科。現有的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法有一系列的問題，比如電鏡技術雖直接、客觀，但對病毒滴度要求高，設備昂貴，并且需要熟練的技術人員，因此檢測價值較低。病毒分離由于技術要求高，分離時間長，易污染的缺點也不易于大量開展。用常規PCR檢測CMV-DNA，具有簡便、快捷等特點。但是由于擴增后的產物需電泳檢測，易造成交叉污染出現假陽性的結果。?

熒光定量PCR是(realtime?fluores-cence?quantitative?PCR，RTFQ?PCR)是1996年由美國Applied?Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有穩定的線性結構的引物和探針，還在于提供一種具有較低的熒光本底值、信噪比高和檢測靈敏度高的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法。?

為實現上述目的，本發明提供一種人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探針的序列為：從5’端起,與靶序列互補的5-10個堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個堿基的環狀結構序列；3’端的5-10個堿基序列；所述5’端的與靶序列互補的5-10個堿基與3’端的5-10個堿基序列部分匹配成頸結構；所述探針成頸環結構，同時探針TM值=（頸環TM值+7）±1，探針5’端有18-25個堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp；所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記非熒光淬滅基團。?

所述探針序列為SEQ?ID?NO:4的序列。?

所述探針序列5’端標記FAM基團，3’端標記Dabcyl非熒光淬滅基團。?

本發明還保護一種人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的任一引物和探針。?

還包括如下成分，樣本提純試劑，PCR擴增試劑、參考品試劑和HCMV定量標準品。?

所述樣本提純試劑為裂解液、洗滌液和重復洗滌液；所述裂解液成分為HCl、二氧化硅、Triton?X-100、EDTA·2Na、異硫氰酸胍；所述洗滌液為HCl、Triton?X-100、EDTA·2Na、異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為HCl、Triton?X-100、EDTA·2Na；所述PCR擴增試劑為HCMV?PCR反應管和HCMV反應緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對照、HCMV臨界陽性對照，HCMV強陽性對照；優選的，所述裂解液為10mMPH7.0HCl、1重量‰二氧化硅、1體積‰Triton?X-100、10mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na；所述HCMV?PCR反應管含有2U?Taq酶、0.01U?UNG酶、0.1mM?EDTA·2Na、25微升石蠟油；HCMV反應緩沖液為10pM?HCMV引物，5pM?HCMV探針、20mMPH9.0HCl、50mM?KCl、1.5mM?MgCl2、0.1mM?EDTA·2Na、0.2mM?dNtps。?

本發明還提供一種應用所述引物和探針或所述試劑盒進行人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，?

樣品制備；制備得到純化的核酸；?

PCR擴增和熒光值讀取，采用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒；?

結果判定。?