[發明專利]一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201410007284.7
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN103805713A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 魏超;林家旺;魏劭
• 申請（專利權）人: 廈門安普利生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 方惠春

1.一種人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探針的序列從5’端起,與靶序列互補的5-10個堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個堿基的環狀結構序列；3’端的5-10個堿基序列；所述5’端的與靶序列互補的5-10個堿基的單鏈堿基序列與3’端的5-10個堿基序列部分匹配成頸結構；所述探針成頸環結構，同時探針TM值=（頸環TM值+7）±1，探針5’端有18-25個堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp；所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記非熒光淬滅基團。

2.權利要求1的人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列為SEQ?ID?NO:4的序列。

3.權利要求1或2的人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列5’端標記FAM基團，3’端標記Dabcyl非熒光淬滅基團。

4.一種人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-3的任一引物和探針。

5.權利要求4的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，還包括如下成分，樣本提純試劑，PCR擴增試劑、參考品試劑。

6.權利要求5的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述樣本提純試劑為裂解液、洗滌液和重復洗滌液；所述裂解液成分為HCl、二氧化硅、Triton?X-100、EDTA·2Na、異硫氰酸胍；所述洗滌液為HCl、Triton?X-100、EDTA·2Na、異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為HCl、Triton?X-100、EDTA·2Na；所述PCR擴增試劑為HCMV?PCR反應管和HCMV反應緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對照、HCMV臨界陽性對照，HCMV強陽性對照和HCMV定量標準品；優選的，所述裂解液為10mMPH7.0HCl、1重量‰二氧化硅、1體積‰Triton?X-100、10mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na；所述HCMV?PCR反應管含有2U?Taq酶、0.01U?UNG酶、0.1mM?EDTA·2Na、25微升石蠟油；HCMV反應緩沖液為10pM?HCMV引物，5pM?HCMV探針、20mMPH9.0HCl、50mM?KCl、1.5mM?MgCl2、0.1mM?EDTA·2Na、0.2mM?dNtps。

7.一種應用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒進行人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，

樣品制備；制備得到純化的核酸；

PCR擴增和熒光值讀取，采用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒；

結果判定。

8.權利要求7的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述樣品制備為取0.5mL離心管加入裂解液100μL，然后加入待測樣本50μL，混懸，室溫靜置10分鐘進行裂解；10000g離心25秒，去上清；加入150μL洗滌液對所得到的沉淀進行洗滌，混懸，10000g離心25秒，去上清；加入150μL重復洗滌液，混懸，10000g離心25秒，去上清備用，純化得到的沉淀即為核酸；所述裂解液為10mMPH7.0HCl、1重量‰二氧化硅、1體積‰Triton?X-100、10mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為10mMPH7.0HCl、1體積‰Triton?X-100、1mM?EDTA·2Na。

9.權利要求8的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為，38℃5分鐘，95℃10分鐘；進入以下循環：95℃15秒，58℃50秒，共40循環；所述熒光值讀取為在PCR擴增每個循環的58℃，30秒時。

10.權利要求8的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述結果判定為：

如果檢測樣本中病毒載量為5.0×10²Copies/mL≤HCMV?DNA≤5.0×10⁸Copies/mL判斷為陽性，直接報告定量結果；

如果檢測樣本中病毒載量為＞5.0×10⁸Copies/mL，判斷為陽性，報告為＞5.0×10⁸Copies/mL；

如果檢測樣本中病毒載量為0Copies/ml，判斷為陰性，報告為0.0Copies/ml；

如果檢測樣本中病毒載量為＜5.0×10²Copies/mL，Copies數僅供參考，建議重新檢測。