[發(fā)明專利]一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410006972.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN103740701A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃志清;陳小玲;溫萬雪;楊亭;徐孟;陳代文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法。

背景技術(shù)

肌纖維是肌肉的基本組成單位。根據(jù)其代謝特點(diǎn)，肌纖維分為有氧代謝型（紅肌纖維）和酵解代謝型（白肌纖維），根據(jù)其收縮特性，肌纖維分為慢肌纖維（Ⅰ型纖維）和快肌纖維（Ⅱ型纖維）。紅肌纖維多為慢肌纖維，而白肌纖維多為快肌纖維。肌纖維數(shù)目在動(dòng)物出生時(shí)已經(jīng)穩(wěn)定，但其類型在出生后易受內(nèi)因和外因影響而發(fā)生轉(zhuǎn)化。肌纖維類型與畜禽肉品質(zhì)密切相關(guān)，提高Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例可有效地改善畜禽肉品質(zhì)。

Sox6是轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的重要成員，存在于多種組織中，并以骨骼肌中的含量最豐富，且快肌多于慢肌。人工突變或缺失Sox6基因的動(dòng)物，其慢肌纖維相關(guān)基因表達(dá)水平顯著提高，Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例明顯增加，肌肉顏色鮮紅。因此，Sox6在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。

反轉(zhuǎn)錄：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶以及Oligo(dT)和/或隨機(jī)引物的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

簡(jiǎn)并PCR克隆未知基因編碼區(qū)全序列：根據(jù)已知的其他物種該基因編碼區(qū)序列，分別在包含起始密碼子和終子密碼子處設(shè)計(jì)并合成多條不同核苷酸序列組成的混合引物（簡(jiǎn)并引物），再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，以簡(jiǎn)并引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后涂布于含相應(yīng)抗生素的固體LB平板，倒置于生化培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取幾個(gè)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR（直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增）初步鑒定后，提取該菌落的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定。克隆到T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后不僅可以將含有目的片段的質(zhì)粒以保存菌種的方式長(zhǎng)期保存，在需要時(shí)可利用大腸桿菌大量復(fù)制該質(zhì)粒，還可以克服PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)測(cè)序引物近端的堿基無法通過測(cè)序獲得的缺點(diǎn)。該技術(shù)僅需知曉相近物種某基因編碼區(qū)序列，便可快速獲得未知的其他物種該基因編碼區(qū)全序列。該技術(shù)成功的關(guān)鍵是簡(jiǎn)并引物和PCR擴(kuò)增條件。

在知曉某基因cDNA片段但不知曉其編碼區(qū)全序列的情況下，可以采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得其編碼區(qū)全序列。RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過往5’端和3’端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的基因5’非翻譯區(qū)、編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)的方法。采用RACE技術(shù)來獲得基因編碼區(qū)全序列，成本高、周期長(zhǎng)、工作量大、PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度不明確、技術(shù)難度大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡(jiǎn)單、快捷的獲取豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法，填補(bǔ)了該基因在豬上的空白，為進(jìn)一步研究豬Sox6功能及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

1.一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法，包括以下步驟：

A1、提取豬背最長(zhǎng)肌中的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

A2、引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)：根據(jù)已知的小鼠、大鼠和人的Sox6編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物自起始密碼子處設(shè)計(jì)，下游引物至終止密碼子處設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物為：

上游引物（pSOX6CDSF）：5’-ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’

下游引物（pSOX6CDS?R）：5’-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G)(T/C)TC(T/C)GGG-3’

PCR反應(yīng)體系為50μL[ddH₂O27μL，10×LAPCR?Buffer?Ⅱ（Mg2⁺?free）5μL，dNTP?mixture（2.5mM?each）8μL，MgCl₂（25mM）5μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA（模板）0.5μL，TaKaRa?LA?Taq（5units/μL）0.5μL]。PCR反應(yīng)條件均為95℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10min。

A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；

A4、克隆。