[發(fā)明專利]一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410006972.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN103740701A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃志清;陳小玲;溫萬雪;楊亭;徐孟;陳代文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1、提取豬背最長(zhǎng)肌中的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

A2、引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)：根據(jù)已知的小鼠、大鼠和人的Sox6編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物自起始密碼子處設(shè)計(jì)，下游引物至終止密碼子處設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物為：

上游引物（pSOX6CDS?F）：5’-ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’

下游引物（pSOX6CDS?R）：5’-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G)(T/C)TC(T/C)GGG-3’

PCR反應(yīng)體系為50μL[ddH₂O27μL，10×LA?PCR?Buffer?Ⅱ（Mg2⁺?free）5μL，dNTP?mixture（2.5mM?each）8μL，MgCl₂（25mM）5μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA（模板）0.5μL，TaKaRa?LA?Taq（5units/μL）0.5μL]；PCR反應(yīng)條件均為95℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10min；

A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；

A4、克隆。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A1包括以下步驟：用液氮將3日齡DLY仔豬背最長(zhǎng)肌500mg磨成粉末裝入1.5mL離心管，加入1mL?TRIzol液，用手激烈搖晃混勻后，室溫放置5min；4℃，12,000×g離心10min；將上清液用移液器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的1.5mL離心管，加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖動(dòng)15s后于室溫下靜置3min；4℃，12,000×g離心15min；取上層水相0.4mL至一新的1.5mL離心管，加入0.4mL冰預(yù)冷的異丙醇，輕緩充分混勻，室溫靜置10min；4℃，12,000g離心10min；棄上清，加入1mL75%乙醇（DEPC處理過的水配制）洗滌沉淀一次；4℃，7,500g離心5min；棄上清，晾干殘余乙醇，加入20μL?DEPC處理過的水溶解沉淀；取3μL于紫外/可見光分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及質(zhì)量，剩余RNA樣品于零下80℃貯存；

取1μg總RNA、1μL?Oligo?dT引物（50μM）和1μL?dNTP?mixture（10mM?each），用DEPC處理過的水補(bǔ)充至10μL，65℃加熱變性5min后快速置于冰中，再加入4μL5×PrimeScript?Buffer、0.5μL?RNase?Inhibitor（40U/μL）、4.5μL?DEPC處理過的水和1μL?PrimeScript?RTase（200U/μL），于42℃反應(yīng)45min將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后于70℃作用15min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，立即使用或零下20℃保存?zhèn)溆谩?/p>