[發明專利]一種朱砂葉螨F1538I突變導致的kdr抗性的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410006533.0
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103725784A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 何林;徐志峰;劉炎超;錢坤
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及植物保護技術領域，特別是涉及一種朱砂葉螨F1538I突變導致的kdr抗性的快速檢測方法。

背景技術

朱砂葉螨別名棉紅蜘蛛、棉葉螨、紅葉螨，在我國分布廣泛，華北、華東、華中、華南、東北、云南、甘肅等地區均有發生。可為害的植物有43科146種，主要有豆類、茄子、高粱、辣椒、西瓜、草莓、玉米、蔥、莧菜、桑樹及雜草等。該螨具有極強的繁殖能力，在適宜的生長環境下產卵量多，世代周期短，短時間里就能迅速形成一定數量的種群，然后在植物葉背及葉脈兩側聚集，以口針刺吸植株汁液，并結成絲網，使受害葉片逐漸褪綠，形成無數白色斑點，對植物組織造成嚴重的傷害。在田間，朱砂葉螨危害嚴重時可導致植株葉片完全干枯脫落，甚至成片死亡，造成嚴重的經濟損失。多年來對朱砂葉螨最有效的防治方法就是使用化學藥劑。朱砂葉螨具有個體小、世代短、發育快等特點，使其極易產生抗藥性，因而防治極為困難。至上世紀八十年代末，朱砂葉螨至少對25種殺蟲殺螨劑產生了抗藥性，導致許多殺蟲殺螨劑的效果顯著降低。研究表明，在我國，朱砂葉螨對有機氯、有機磷、有機氮類以及擬除蟲菊酯類的多種農藥已達到中抗至極高抗水平。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑是一類根據具有殺蟲活性的菊花提取物的天然除蟲菊素化學結構而仿生出來的合成殺蟲劑。由于其具有殺蟲活性高、擊倒作用強、對非靶標高等動物低毒及在環境中易降解等特點，因而從其被發現至今三十余年來，被廣泛的用于農業、林業及衛生害蟲防治。在2005年，該類殺蟲劑的銷售額依然占到世界殺蟲劑銷售總量的20%。

害蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑(或DDT)產生抗性的主要原因是由于靶標位點(鈉離子通道)的突變導致靶標與藥劑的結合能力下降引起的，這種突變被命名為kdr突變，由此導致的抗性稱為kdr抗性，而害蟲kdr抗性一旦產生，將導致所有的擬除蟲菊酯類藥劑對該害蟲防治失效。因此，害蟲田間種群kdr抗性的早期預警對于延緩抗藥性、延長藥劑使用壽命、可持續治理害蟲以及保護農產品質量安全意義重大，而發展快速、簡便和靈敏的kdr抗性檢測技術則可為害蟲田間kdr抗性的早期預警提供有力的技術支撐。常規的朱砂葉螨kdr抗性檢測的方法主要是通過增效劑結合生物測定的方法，了解害蟲是否產生了kdr抗性，以及抗性程度有多高。常規檢測方法存在一次所需生物試材多、操作復雜、對害蟲田間kdr抗性的基因型組成無法準確探測等缺點，因此目前急需一種快速、簡便、靈敏的方法檢測田間kdr抗性。

發明內容

本發明的目的是提供一種朱砂葉螨F1538I突變導致的kdr抗性的快速檢測方法，用于朱砂葉螨田間kdr抗性的監測與預警。本發明申請人從甲氰菊酯抗性朱砂葉螨鈉離子通道氨基酸序列鑒定出一個kdr突變F1538I（已公開報道）。本發明的技術路線是：明確朱砂葉螨鈉離子通道氨基酸序列的F1538I突變與其對甲氰菊酯抗藥性是否存在相關關系；如果F1538I突變與朱砂葉螨對甲氰菊酯抗藥性存在相關關系，則基于該突變位點，研究并提出關于朱砂葉螨kdr抗性的簡便、快速和靈敏的分子檢測方法。

1、本發明申請人研究發現，朱砂葉螨鈉離子通道基因F1538I突變頻率與其對甲氰菊酯的抗性水平存在顯著的正相關關系。

2010-2011年間，本發明申請人從南方地區田間采集獲得7個朱砂葉螨野外種群，分別為：重慶市北碚區、重慶市璧山縣、重慶市潼南縣、重慶市武隆縣、浙江省杭州市、湖北省荊州市、云南省個舊市。對各朱砂葉螨野外種群進行對甲氰菊酯抗性水平的生物測定及kdr突變頻率測定。檢測結果顯示，七個野外品系的F1538I突變頻率(13.6%到45%)?隨著藥膜法測定各種群對甲氰菊酯的LC₅₀的升高而上升，說明朱砂葉螨kdr突變F1538I與其對甲氰菊酯抗性相關。將朱砂葉螨地理種群的kdr突變頻率與其對甲氰菊酯抗性水平進行線性回歸分析，發現kdr突變頻率大小與抗性水平高低呈顯著正相關關系（R=0.81525）（圖1）。該結果表明，kdr突變頻率高低與其對甲氰菊酯抗性水平大小之間存在著正相關關系，揭示出kdr突變F1538I與甲氰菊酯抗性密切相關。

基于二者之間的相關關系，使用本發明提供的kdr突變檢測方法，即可測出某一種群的kdr突變頻率（隨機選取30頭以上），將突變頻率X帶入公式Y=23435X+345.16進行計算，可預測該種群的抗性水平Y值（LC₅₀值）。

2、基于F1538I突變，設計特異引物，提出朱砂葉螨kdr抗性PCR檢測方法并驗證其可靠性

設計原理與思路：