[發明專利]一種朱砂葉螨F1538I突變導致的kdr抗性的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410006533.0
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103725784A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 何林;徐志峰;劉炎超;錢坤
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種朱砂葉螨F1538I突變導致的kdr抗性的快速檢測方法，其特征在于通過以下步驟實現：

（1）使用等位基因PCR的方法，根據朱砂葉螨鈉離子通道cDNA序列設計用于kdr突變基因型檢測的特異引物：Primer1和Primer2用于擴增150bp左右非突變片段，?Primer3和Primer4用于擴增600bp左右突變片段；

Primer1??5'-?TTCAAGTGGCAACATTCAAAGG-3'?

Primer2??5'-?AATAAACAGGTTAAGTGTGAA-3'

Primer3??5'-?TTCATCATTTTTGGCTCTTTTA-3'

Primer4??5'-?TGGTCAAGGGACATCACA-3'

（2）單頭提取朱砂葉螨基因組DNA，PCR擴增，PCR體系為：10×PCR?Buffer?Reaction?Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP?mixture2.0μL、S-Forward0.5μL、S-Reverse0.5μL、R-Forward0.5μL、R-?Reverse0.5μL、dd?H₂O14.8μL、基因組DNA1.0μL、Taq?DNA聚合酶0.2μL；PCR程序為：94℃預變性3min，94℃變性1?min，48℃退火1?min，72℃延伸1?min，30個循環結束后72℃延伸10min，16℃保存；

（3）PCR反應完成后，取10μL擴增產物進行1.0%?的瓊脂糖凝膠電泳，經染色后，在凝膠成像系統上觀察并拍照電泳結果；

（4）結果鑒定，樣品出現單一150bp帶，無600bp帶，則基因型為敏感純合子；樣品出現150bp和600bp兩條帶，則基因型為抗性雜合子；樣品出現單一600bp帶，無150bp帶，則基因型為抗性純合子；

（5）根據朱砂葉螨基因型檢測結果計算該種群的突變頻率，將突變頻率X帶入公式Y=23435X+345.16進行計算，得到該種群的抗性水平Y值即LC₅₀值。