[發(fā)明專(zhuān)利]一種靶向性抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與表達(dá)質(zhì)粒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410006518.6
• 申請(qǐng)日: 2014-01-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103755813A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏宏利;鄧安梅;孫小波;方超平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66;A61K38/16;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，其特征在于，所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的編碼基因，其特征在于，所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

3.一種如權(quán)利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體為含有如SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的重組載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體pET28a。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：

A、基因突變體mAnxA5的構(gòu)建

第一步：進(jìn)行點(diǎn)突變，將AnnexinA5基因第二結(jié)構(gòu)域中“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列

將纈氨酸突變?yōu)榫彼岵捎弥丿B區(qū)基因擴(kuò)增法，共需合成四條引物，分別為：

P1:5’GC?CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ?ID?NO:5)

P2:5’GTCCCCACGCACCACGTCATCTTC3’(SEQ?ID?NO:6)

P3:5’GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTAC3’(SEQ?ID?NO:7)

P4:5’TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3’(SEQ?ID?NO:8)

其中：

P1與AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco?I酶切位點(diǎn)CCATGG；

P2含有精氨酸密碼子的互補(bǔ)核苷酸序列ACG；

以含有AnnexinA5基因的質(zhì)粒pUC119-AnxA5為模板，P1,P2為引物擴(kuò)增，得到的序列稱(chēng)為P1P2；

P3含有精氨酸密碼子序列CGT；

P4同AnnexinA5的3’末端互補(bǔ)，以含有AnnexinA5基因的質(zhì)粒pUC119-AnxA5為模板，P3,P4為引物擴(kuò)增，得到的序列稱(chēng)為P3P4；

引物P2,P3具有一段互補(bǔ)的序列，所以P1P2和P3P4的序列中也存在這一互補(bǔ)序列，將P1P2和P3P4變性后退火，可以在這段互補(bǔ)區(qū)形成雙鏈；提供PCR反應(yīng)條件，P1P2和P3P4可以互為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物為P1P4；通過(guò)這種方法，將AnnexinA5第二結(jié)構(gòu)域中“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列；

第二步：PCR擴(kuò)增P1P4序列中的第一、二結(jié)構(gòu)域，得到突變體基因mAnxA5

以P1P4為模板，以P1,P5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物即突變體基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；

P1:5’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ?ID?NO:5)

P5:5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3’(SEQ?ID?NO:9)

P1與第一步所用的P1相同，P5與編碼AnnexinA5第154-157位氨基酸殘基的核苷酸序列互補(bǔ)；

將PCR產(chǎn)物P1P5克隆入質(zhì)粒Puc19進(jìn)行測(cè)序,證明所獲得的序列與SEQ?ID?NO:1完全相同；

B、融合基因mAnxA5-MLT的構(gòu)建方法采用重疊區(qū)延伸法連接，MLT的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；

C、表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mAnxA5-MLT的構(gòu)建

利用基因工程手段將融合基因mAnxA5-MLT用EcoR?I、Sal?I雙酶切，然后與EcoR?I、Sal?I雙酶切的載體pET-28a（+）連接，酶切結(jié)果證實(shí)，插入片段在500和750bp之間有一條帶，與預(yù)期大小相符，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

7.一種如權(quán)利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

8.一種如權(quán)利要求2所述的編碼基因在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

9.一種如權(quán)利要求3、4、5或6所述的表達(dá)載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

10.一種如權(quán)利要求7所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌。