[發明專利]用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201410006330.1
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103760362A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 陳朝銀;方娟;趙聲蘭;葛鋒;劉迪秋;熊向峰;韓本勇
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用于核桃蛋白定性定量檢測的夾心ELISA試劑盒及其檢測方法，屬于食品領域。

背景技術

近年來，隨著人民生活水平的提高，食品安全問題日益凸顯。“三聚氰胺事件”更使人們強化了非食品用添加劑的食品安全問題，但食用添加劑的不合法添加形勢日趨惡劣，如各種各樣蛋白飲品(粉、乳等)中魚龍混雜的蛋白原料添加，各種各樣的調制奶、酸奶、核桃乳、核桃粉、奶粉中添加大豆粉等，牛奶、黃牛奶、山羊奶、馬奶等的相互摻假問題，極大的影響了食品消費市場的安全和消費者的消費信心。因此，加強其檢驗方法的研究迫在眉睫。

目前蛋白質檢測方法主要包括：蛋白質電泳技術、液相色譜技術、生物質譜技術、近紅外光譜技術、免疫技術等。其中只有ELISA檢測法具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強、經濟等優點。國內已有利用大豆蛋白多克隆抗體ELISA方法測定火腿腸大豆蛋白含量，利用提純牛乳酪蛋白免疫試驗動物，獲得針對酪蛋白的多克隆抗體，建立了牛奶中牛奶蛋白質含量的ELISA檢測方法，具有良好的特異性、敏感性、重復性。我們在之前的工作中已成功建立了一種間接ELISA方法用來對核桃蛋白定量檢測及摻假檢驗，但該方法及提供的試劑盒仍然具有穩定性差、重復性弱等缺點。在此工作基礎上，將間接法進行改善，改進成一種雙抗夾心ELISA方法，具有良好的重復性、穩定性和特異性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，通過制備兩種抗核桃蛋白多克隆抗體，建立了一種夾心ELISA法，為我國食品行業中核桃蛋白定量和摻假問題提供了一種重要的監測手段；該試劑盒包括ELISA酶標板、陽性抗原、酶標二抗、稀釋液、底物顯色液、終止液、洗滌液；其中ELISA酶標板為一抗包被的ELISA酶標板，一抗為豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗體，酶標二抗為HRP標記的兔抗核桃蛋白多克隆抗體，其它試劑為ELISA試劑盒公知的、市場上有產品銷售的組分。

本發明試劑盒可包括如下組分：

（1）????????ELISA?96孔酶標板：每個試劑盒裝有一塊真空包裝的ELISA板，該ELISA板由豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗體以體積比1:5000的比例稀釋后按常規方法進行包被；ELISA板含有可拆卸ELISA微孔板條，規格為：8孔×12條或8條×12孔；

（2）陽性抗原：核桃蛋白10μL；

（3）酶標二抗：HRP標記的兔抗核桃蛋白多克隆抗體使用液10μL；

（4）底物顯色液：0.1‰TMB，10mL；

（5）終止液：2M的硫酸溶液10mL；

（6）洗滌液：0.1M?pH7.4?PBST溶液30mL；?

（7）稀釋液：含5%脫脂牛奶的PBST?30mL，作為樣品、抗體稀釋液；?

本發明中利用常規等電點法、透析法、濾膜過濾法制備陽性抗原核桃蛋白，具體操作如下：?

1）按每克磨好的核桃粉添加5~10ml的石油醚的比例，用石油醚對核桃粉進行脫脂2~3次后，自然風干，得脫脂核桃粉；

2）將石油醚脫脂核桃粉溶解于核桃粉質量5~10倍水中，調節溶液pH至10~12，然后在55~60℃水浴攪拌提取1~3h，再調節溶液pH值至6.5~7.5進行沉淀；

3）然后溶液3000r/min離心20min，取上清液放入5Kd透析袋透析24~72h，收集透析袋內溶液，經0.45μm和0.22μm濾膜依次過濾，濾液即為核桃蛋白抗原溶液，然后測定蛋白濃度，調整至6~10mg/mL，分裝，-20℃保存備用。

本發明中所述豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下：?

1）將純化的核桃蛋白抗原與弗氏完全佐劑以質量（g）：體積（ml）≥0.0001的比例混合乳化15~60分鐘，乳化完全后免疫豚鼠，此為基礎免疫；

2）之后分別間隔三周、兩周、兩周使抗原與弗氏不完全佐劑以質量（g）：體積（ml）≥0.00005的比例混合乳化，進行三次加強免疫；第三次加強免疫前，采集血清2mL，ELISA法檢測效價；兩周后靜脈注射純抗原，沖刺免疫兩次，兩次沖刺免疫間間隔一周；

3）最后一次免疫7天后，按公知的血清制備方法采血，置于37℃恒溫箱中2h，4℃過夜→4℃10000g離心→收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗體，分裝，于-20℃以下保存備用。

本發明中所述兔抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下：