[發明專利]用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201410006330.1
• 申請日: 2014-01-07
• 公開（公告）號: CN103760362A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 陳朝銀;方娟;趙聲蘭;葛鋒;劉迪秋;熊向峰;韓本勇
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，包括ELISA酶標板、陽性抗原核桃蛋白、酶標二抗、稀釋液、底物顯色液、終止液、洗滌液；其特征在于：ELISA酶標板為一抗包被的ELISA酶標板，一抗為豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗體，酶標二抗為HRP酶標記的兔抗核桃蛋白多克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，其特征在于豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下：

1）將純化的核桃蛋白抗原與弗氏完全佐劑以質量：體積≥0.0001的比例混合乳化15~60分鐘，乳化完全后免疫豚鼠，此為基礎免疫；?

2）之后分別間隔三周、兩周、兩周使抗原與弗氏不完全佐劑以質量：體積≥0.00005的比例混合乳化，進行三次加強免疫；第三次加強免疫前，采集血清2mL，ELISA法檢測效價；兩周后靜脈注射純抗原，沖刺免疫兩次，兩次沖刺免疫間隔一周；

3）最后一次免疫7天后，按公知的血清制備方法采血，置于37℃恒溫箱中2h，4℃過夜→4℃10000g離心→收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗體，分裝，于-20℃以下保存備用。

3.根據權利要求1所述的用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，其特征在于兔抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下：

1）將純化的核桃蛋白抗原與弗氏完全佐劑以質量：體積≥0.0001的比例混合乳化15~60分鐘，乳化完全后免疫新西蘭大白兔，此為基礎免疫；

2）之后每隔兩周抗原與弗氏不完全佐劑以質量：體積≥0.00005混合、乳化，進行兩次加強免疫；第二次加強免疫前，采集血清2mL，ELISA法檢測效價；兩周后靜脈注射純抗原，沖刺免疫一次；

3）最后一次免疫7天后，按公知的血清制備方法采血，置于37℃恒溫箱中2h，4℃過夜→4℃10000g離心→收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗體，分裝，于-20℃以下保存備用。

4.權利要求1所述用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒的檢測方法，其特征在于按如下檢測步驟進行：

1）加樣：將標準核桃蛋白和樣品核桃制品用稀釋液分別稀釋成為不同的濃度，并加入酶標板，100μL/孔，37℃孵育1h；

2）洗滌：棄樣品液，在吸水紙上拍干，加洗滌液300μL/孔，微震蕩3min/次，洗滌3次；

3）加酶標二抗：按體積比1:1000的比例稀釋酶標二抗，加稀釋過的酶標二抗溶液，100μL/孔，?37℃孵育1h；

4）之后采用公知的洗滌→加底物顯色液→加終止液→OD值檢測等ELISA常規方法進

5）建立標準曲線：用不同稀釋度的核桃蛋白標準溶液經上述步驟測定得到的OD₄₅₀，建立標準曲線及回歸方程；

6）用不同稀釋度的核桃制品溶液經上述步驟測定得到的OD₄₅₀中有線性關系的數據代入標準曲線回歸方程計算出核桃制品中核桃蛋白的含量，從而分析出樣品中核桃蛋白的濃度，再根據核桃制品凱氏定氮法測定得到總蛋白含量，即可計算出核桃制品中是否摻有非核桃蛋白以及摻入程度。