[發明專利]一種生產乳酸同時耦合制備GABA的方法

有效

• 申請號: 201410005905.8
• 申請日: 2014-01-03
• 公開（公告）號: CN103773819A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 梅樂和;趙偉睿;黃俊;胡升;雷引林;胡桂香;金志華
• 申請（專利權）人: 浙江大學寧波理工學院
• 主分類號: C12P7/56
• 分類號: C12P7/56;C12P13/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于生物化學工程領域，尤其涉及一種生產乳酸同時耦合制備GABA的方法。

背景技術

乳酸是一種重要的工業原料，長期以來被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、農業和化工領域。此外，乳酸可以用來制備聚乳酸等工程材料。而聚乳酸可被用來制造完全生物降解性塑料，生產綠色包裝材料和農用薄膜，以消除“白色污染”所帶來的環境危機。另外，由于聚乳酸具有良好的生物相容性，還廣泛應用于醫藥工業領域，包括醫用縫合線、藥物緩釋材料、骨固定修復材料及其它組織工程用材料等。隨著市場對聚乳酸需求量的不斷增大，也進一步促進了市場對乳酸需求量的不斷增大。因此，開發高效的乳酸生產技術長期以來一直受到廣泛的關注。

乳酸的生產主要有化學合成法和發酵法，與化學合成法相比，由于生物發酵法的原材料豐富、操作溫度低、能耗低以及產物的光學純度高的特點，而被廣泛采用。目前，全世界的乳酸主要都是通過發酵法生產（Abdel-Rahman?et?al.,2011）。但是，對于乳酸發酵來說，由于乳酸引起的產物抑制已成為有效發酵的主要瓶頸問題。在乳酸發酵過程中，不斷生成的乳酸使發酵液pH逐漸降低，較低的pH值對菌體正常生長和產酸過程會產生強烈的抑制，因此必須通過控制發酵過程中的pH來解除產物抑制。

目前，常用的pH控制方法是添加堿性物質如各種碳酸鹽、氫氧化物及氨水等，其中CaCO₃是最常用的中和劑。然而，在使用CaCO₃作為中和乳酸發酵中產生的乳酸時，發酵罐中大量的CaCO₃容易使取料口堵塞；在發酵中后期，高濃度的乳酸鈣使發酵液變得黏稠，生成大量泡沫，造成逃液；或發生固化現象，使發酵難以繼續。此外，使用CaCO₃作為中和劑存在提取工藝流程長，消耗工業原料多以及回收率低，同時產生大量硫酸鈣廢渣和廢水，環保壓力大，增加處理成本，能耗高等問題。

因此，開發新的解除乳酸發酵過程中產物抑制的方法來代替傳統的CaCO₃中和法具有十分重要的現實意義。

發明內容

本發明提供了一種生產乳酸同時耦合制備GABA的方法，為乳酸發酵提供了一種新的解除底物抑制的方法，并且在發酵過程中還可以耦合制備功能化合物γ-氨基丁酸。

一種生產乳酸同時耦合制備GABA的方法，其特征在于，包括：

將米根霉接入發酵培養基中進行發酵，當發酵液的pH小于4.8時，向發酵液中加入谷氨酸脫羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸鈉，之后持續向發酵液中加入L-谷氨酸鈉維持發酵液的pH為4.8～6.0。

谷氨酸脫羧酶（Glutamate?decarboxylase，GAD；EC4.1.1.15）可以在酸性條件下，通過消耗H⁺，催化L-谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric?acid，GABA）。GABA具有降血壓、利尿、抗驚厥、預防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、促進激素分泌和保肝利腎等多種生理功能。此外，GABA可作為前體物質來合成生物可降解材料聚酰胺-4和環境有好的塑料溶劑N-吡咯烷酮等化工產品。本發明將乳酸發酵與谷氨酸脫羧酶的脫羧反應進行耦合，利用谷氨酸脫羧酶的脫羧反應來消耗掉乳酸發酵過程中產生的H⁺，來解除乳酸發酵過程中的產物抑制，同時實現乳酸與GABA的同時生產。發酵中發生的主要反應為：

另外，本發明通過谷氨酸脫羧酶的脫羧反應維持發酵液的pH為4.8～6.0，在該pH條件下，有利于發酵反應的進行，產生大量的乳酸，同時該pH條件還保證了脫羧反應的順利進行，以解除發酵過程中的產物抑制。

乳酸發酵時，本發明采用米根霉為發酵微生物，米根霉的耐酸性較強，在乳酸發酵過程中，具體的，可以為米根霉As3.819。

磷酸吡哆醛作為谷氨酸脫羧酶的輔酶，通過在發酵液中添加磷酸吡哆醛，可避免在長時間、多批次的發酵過程中谷氨酸脫羧酶的失活，促進谷氨酸脫羧，增進γ-氨基丁酸的生成，所述磷酸吡哆醛的終濃度為0.01～1mM，優選為0.1mM。

為了提高谷氨酸脫羧酶在體系中的穩定性，簡化酶的后續分離，所述的谷氨酸脫羧酶加入前經固定化處理。固定化處理的方法具體可采用常規的手段。

所述固定化的谷氨酸脫羧酶的來源形式可以為純化后的谷氨酸脫羧酶、含谷氨酸脫羧酶的粗酶液或者表達有谷氨酸脫羧酶的細胞。為避免酶提取與純化步驟成本，提高酶的利用率與穩定性，優選的，以重組表達有谷氨酸脫羧酶的菌體細胞的方式進行添加。