[發明專利]一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201410004766.7
• 申請日: 2014-01-06
• 公開（公告）號: CN103704204A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 韓龍江;黃雯;劉清華;闕華勇;李莉;紀利芹;李軍;溫海深
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;劉陽

技術領域

本發明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法，把太平洋牡蠣胚胎經過抗凍保護劑處理、降溫冷凍、置于液氮中長期保存及復溫培育的過程。

背景技術

太平洋牡蠣(Crassostrea?gigas)屬于牡蠣科，巨蠣屬，俗稱真牡蠣，其個體較大，在我國主要分布于山東及遼寧地區，其肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，尤其蛋白質、脂肪、肝糖、碘、維生素等營養物質含量豐富，有海洋牛奶之美稱。20世紀80年代從日本、澳洲和臺灣地區引入我國，在我國養殖十分廣泛，目前已經成為我國最重要的養殖貝類，具有極高商業開發價值的海洋經濟動物。近年來，由于養殖規模的不斷擴大，對太平洋牡蠣種質需求也不斷擴大，然而近幾年來，由于累代養殖、近親交配造成了種質退化、雜合度降低等一系列問題，致使太平洋牡蠣的生長速度與引進初期相比明顯下降，養成周期不斷延長。因此，選育具有優良生長性狀的太平洋牡蠣品系、建立太平洋牡蠣的胚胎冷凍技術成為太平洋牡蠣養殖的當務之急。太平洋牡蠣胚胎的超低溫保存在水產養殖、遺傳育種以及種質資源保存中具有重要的意義：太平洋牡蠣胚胎的超低溫保存對于太平洋牡蠣這種海水名貴貝類的種質保存、遺傳多樣性和育種、可持續養殖、種質的長距離運輸、貝類品的選育以及基因多樣性的保護等方面有著重要意義

發明內容

本發明的目的在于提供一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

從養殖場購得太平洋牡蠣，解剖取的精液和卵子，經人工授精獲得太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，加入抗凍保護劑，預冷后裝入0.5ml或者0.25ml的麥管中進行分步降溫，-40℃前采用兩步慢速降溫，-40℃后采用快速降溫至-180℃后直接投入液氮中保存28℃水浴解凍復溫培育，采用計算機輔助分析（CASA）檢測太平洋牡蠣胚胎的運動率。所述太平洋牡蠣胚胎為擔輪幼蟲期胚胎，人工受精后于19±1℃溫度條件下培養12-14h后發育至擔輪幼蟲期，用于胚胎冷凍保存。

所述冷凍保存的太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，是經200目篩絹過濾濃縮獲得。

所述抗凍保護劑為10%DMSO（V/V，DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積），太平洋牡蠣胚胎中提前添加有0.2M的海藻糖溶解混勻。

所述太平洋牡蠣擔輪幼蟲加入海藻糖和抗凍保護劑后充分混勻，在0～4℃冰箱中預冷30分鐘。

所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積）太平洋牡蠣胚胎預冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麥管中，用封口粉封口后放入程序降溫儀進行程序降溫。

所述兩步慢速降溫是指0～-15℃降溫速率為-1℃/分鐘，-15～-40℃降溫速率為-3℃/分鐘，并且在-15℃停留3分鐘，以便其充分形成冰核。所述快速降溫是指-40～-180℃降溫速率為-20℃/分鐘，降至-180℃后取出，立即投入液氮中長期保存。

所述保存后的太平洋牡蠣擔輪幼蟲解凍時，用鑷子從液氮中取出裝有太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎的麥管，放入28℃水浴輕輕搖晃解凍至麥管開始呈現透明狀態后取出，室溫放至完全融化，剪刀剪開麥管兩端放入海水中培育，獲取復活胚胎。

所述培育胚胎的海水，是將海水經煮沸消毒后，按海水體積計加有5%BSA。

本發明具有如下優點：

1.本發明采用200目篩絹過濾濃縮太平洋牡蠣胚胎，保存胚胎量大；

2.本發明冷凍保存擔輪幼蟲期太平洋牡蠣的胚胎，抗凍能力強，解凍后活力高；

3.本發明采用0.25和0.5ml麥管裝太平洋牡蠣胚胎，溫度控制更加精密；

4.本發明采用10%（v/v）二甲亞砜（DMSO）為抗凍保護劑，保持較好滲透性的同時又降低了毒性；

5.本發明抗凍液中加入了0.2M海藻糖作為添加劑，通過其非滲透性保護作用對胚胎的質膜起到很好的保護作用；

6.本發明降溫前太平洋牡蠣擔輪幼蟲與抗凍液混勻，4℃冰箱中預冷30分鐘，既能保證抗凍保護劑充分滲入到太平洋牡蠣胚胎內部，又不會因抗凍保護劑本身的毒性作用對胚胎造成過大的損害；

7.本發明慢速降溫時，首先采用以-1℃/min速度降溫，降至-15℃后平衡3分鐘，以便太平洋牡蠣胚胎內部形成冰核，又以-3℃/min降至-40℃，使冷凍胚胎安全度過“危險溫度區”節省了時間，操作簡便易行；

8.本發明采用-20℃/min的降溫速率快速進入穩定狀態-180℃，然后投入液氮，整個降溫過程時間短，實用性強；