[發(fā)明專利]一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410004766.7
• 申請(qǐng)日: 2014-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN103704204A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓龍江;黃雯;劉清華;闕華勇;李莉;紀(jì)利芹;李軍;溫海深
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;劉陽(yáng)

1.一種太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲期胚胎，加入抗凍保護(hù)劑，預(yù)冷后裝入麥管中進(jìn)行分步降溫，-40℃前采用兩步慢速降溫，-40℃后采用快速降溫至-180℃后直接投入液氮中保存，28℃水浴解凍復(fù)溫培育，檢測(cè)運(yùn)動(dòng)率。

2.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蠣胚胎為擔(dān)輪幼蟲期胚胎，受精后于19±1℃溫度條件下培養(yǎng)12-14h后發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲期。

3.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲期胚胎，經(jīng)200目篩絹過濾濃縮。

4.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述抗凍保護(hù)劑為10%DMSO（V/V，DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積），太平洋牡蠣胚胎中添加有0.2M的海藻糖。

5.按照權(quán)利要求1或4所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲加入海藻糖和抗凍保護(hù)劑后充分混勻，在0～4℃冰箱中預(yù)冷30分鐘。

6.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積）太平洋牡蠣胚胎預(yù)冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麥管中，用封口粉封口后放入程序降溫儀進(jìn)行程序降溫。

7.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述兩步慢速降溫是指0～-15℃降溫速率為-1℃/分鐘，-15～-40℃降溫速率為-3℃/分鐘，并且在-15℃停留3分鐘。

8.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述快速降溫是指-40～-180℃降溫速率為-20℃/分鐘，降至-180℃后直接投入液氮中長(zhǎng)期保存。

9.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述保存后的太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲解凍時(shí)取出裝有擔(dān)輪幼蟲的麥管，放入28℃水浴解凍至麥管呈透明狀態(tài)取出，室溫放至完全融化，剪開麥管兩端放入海水中培育，獲取復(fù)活胚胎。

10.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于：所述培育胚胎的海水，是將海水消毒后，按海水體積計(jì)加有5%BSA。