[發明專利]載脂蛋白AⅠ抗血清的制備方法

有效

• 申請號: 201410004059.8
• 申請日: 2014-01-06
• 公開（公告）號: CN104017076A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 楊昌國
• 申請（專利權）人: 寧波博泰生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種生物醫藥領域，具體涉及一種載脂蛋白AⅠ抗血清的制備方法。

背景技術

載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）是人血清中高密度脂蛋白（HDL）的主要結構蛋白，約占HDL質量的32.5-35.0%?,因此，ApoAⅠ含量可以代表HDL水平，并與HDL中的膽固醇呈明顯正相關。臨床上ApoAⅠ測定常作為心腦血管病的風險度估計和ApoAⅠ缺乏癥（如Tangier病：是一種罕見的遺傳性疾病）的診斷。所有ApoAI的免疫測定技術均需用ApoAⅠ抗血清，目前國際和國內通用的ApoAⅠ測定試劑盒均采用免疫透射比濁法(Immunoturbidimetric?assay,ITA)，因其快速、準確、精密并適用于各種類型的自動生化分析儀，特別適用大批量標本的測定。為了滿足臨床檢驗需要，大批量制備高純度ApoAⅠ抗血清顯得非常重要。

傳統技術制備載脂蛋白A1抗血清，是直接用人血清通過二次超速離心制備獲得HDL，然后使用Sephsrose?4B柱層析，收集主峰為HDL組份，再用醇和醚作為溶劑，醇和醚的體積比例為2：3，在-20℃下連續攪拌12-16小時進行在脫脂，經過濾，將濾紙上的去脂HDL(ApoHDL)烘干，然后將其溶解經Sephadex?G-150柱層析,?收集主峰Ⅱ為ApoA1組份,再經DEAE纖維素離子交換層析得純品。再把制得的ApoA1免疫動物，以每次3mg/每只免疫動物的劑量進行免疫，免疫4-5次，甚至更多，制備獲得ApoA1的抗血清。

傳統方法直接從血漿中超速離心獲得HDL需要的離心次數多，且耗時長，而且用有機溶劑對HDL進行脫脂的工藝要求嚴格，步驟控制難，如脫脂不完全，會影響ApoAⅠ的產率，甚至完全失敗，而且在進行動物的免疫過程時，耗費的時間過長，制備時間緩慢，而且免疫動物時，免疫次數多、免疫的效價和成功率也極低。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種載脂蛋白AⅠ抗血清的制備方法，該制備方法的優點有：

1).用多陰離子和二價金屬離子制備濃縮的HDL粗品，使后續的超速離心次數和時間大大節省，為大批量提取ApoAⅠ提供了條件；

2)用鹽酸胍處理代替傳統的有機溶劑低溫脫脂步驟，方法簡便，省時、透析后用凝膠柱層析，收集主峰為高純度的ApoAⅠ且得率提高；

3)合理提高抗原劑量免疫動物，可縮短抗血清的制備時間，只須傳統方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比傳統方法提高。

為實現上述目的，本發明的載脂蛋白AⅠ抗血清的制備方法，包括如下步驟：

1)?高密度脂蛋白的提取：將用于制備載脂蛋白AⅠ的血清通過濃度為6%-22%的多陰離子化合物和濃度為2-6mol/L的二價金屬離子處理后提純獲得高密度脂蛋白；

2)?載脂蛋白AⅠ的提取：將獲得的高密度脂蛋白通過濃度為4-10mol/L鹽酸胍處理后經過超速離心、梯度層析，獲得載脂蛋白AⅠ；

3)?載脂蛋白AⅠ抗血清的制備：將載脂蛋白AⅠ作為抗原，對免疫動物進行免疫反應，制備載脂蛋白AⅠ抗血清。

通過采用上述方案，將血清先通過低濃度的多陰離子化合物和二價金屬離子處理后能夠使血清中的低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白沉淀，然后再加大二者濃度沉淀高密度脂蛋白，能夠減少傳統工藝當中的離心所花的時間和材料，使ApoAⅠ抗血清制備的效率大大提升，為大批量提取ApoAⅠ提供了條件；然后通過超速離心（密度范圍用d?=1.075-1.190），目的是去掉低端富含ApoC和高端富含ApoE的HDL顆粒，有利于后繼的載脂蛋白A1的提純，同時將HDL用鹽酸胍處理，相比傳統的醇醚脫脂(在低溫下連續拌)，無機試劑的反應條件更加容易控制，而且工藝要求簡單，避免了HDL脫脂時出現問題而影響ApoAⅠ的產率的情況發生，方法簡便，省時、透析后用凝膠柱層析，收集主峰為高純度的ApoAⅠ且得率提高；最后通過用將ApoAⅠ作為抗原注射到免疫動物身上，通過免疫動物本身的免疫反應產生ApoAⅠ抗血清，通過合理的加大劑量，可縮短抗血清的制備時間，而且免疫的成功率亦比傳統方法提高。

本發明的進一步設置為，所述第1)步驟中，所述用于制備載脂蛋白AⅠ的血清通過多陰離子化合物和二價金屬離子處理后，需再經過濃度為0.3-1mol/L的草酸鉀獲得高密度脂蛋白粗品。?

通過采用上述方案，將通過多陰離子化合物和二價金屬離子處理后的血清用0.3-1mol/L的草酸鉀進行處理，能夠除去其中多余的多陰離子和二價金屬離子，確保二者不會對后續的制備產生影響。