[發明專利]一種用于監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法

有效

• 申請號: 201410002215.7
• 申請日: 2014-01-03
• 公開（公告）號: CN103712934A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 邱素艷;林振宇;周瑤敏;羅林廣;陳國南
• 申請（專利權）人: 江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 江西省專利事務所 36100
• 代理人: 張文

技術領域

本發明屬于分析化學領域，尤其是涉及一種用于監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法。

背景技術

漆酶（EC?1.10.3.2）主要分布在大部分植物和真菌中。由于漆酶能有效催化大量有機和無機化合物，將化合物中分子氧還原為水，例如酚類化合物和有機胺類，因此被廣泛用于免疫檢測、生物傳感、染料的合成和脫色等領域。此外，漆酶還是一種多銅蛋白，包括4個銅離子，可分為三類：分別為分布在三區的I型銅（Cu1），以及分布在一區與三區交界處的II型銅（Cu2）和III型銅（Cu3a?and?Cu3b）。在漆酶結構中，這些銅離子均與組氨酸和色氨酸相結合，共同作為漆酶的催化中心。

在生理條件下，許多蛋白質都以本身自然折疊的形式存在，其中氫鍵在蛋白質折疊過程中發揮著舉足輕重的作用。如果將蛋白質進行加熱，或暴露在酸性、堿性環境，或與變性劑如尿素、鹽酸胍和乙醇等物質相混合時，都容易使蛋白質中的氫鍵發生斷裂，引起蛋白質產生去折疊作用，導致蛋白質構象發生變化，例如三維結構坍塌，成為一維或者二維結構。為了更好地了解蛋白質功能與它的序列、構象之間的關系，研究者們提出很多監測方法用于研究蛋白質的折疊和去折疊狀態、以及構象變化過程等，例如熒光法、圓二色譜法、毛細管電泳法、質譜法、電化學法、近紅外光譜法等。紫外吸收光譜法由于成本低、操作簡單、選擇性高而受到廣泛關注，但是目前采用紫外吸收光譜法對蛋白質構象變化進行監測的報道非常少。因此，開發一種簡單、高效的免標記紫外吸收光譜法去監測蛋白質的構象變化是十分必要的。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種方法簡單、成本低、特異性好的用于監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，該方法在操作過程中僅需要將漆酶、3-疊氮-7-羥基香豆素在尿素溶液中進行簡單混合，不需要任何的標記過程，從而大大降低了操作的復雜性，減少了監測時間。

本發明的目的是按照如下方式實現的：

一種用于監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，特征是：具體步驟如下：

（1）按照參考文獻（Sivakumar,?K.;?Xie,?F.;?Cash,?B.?M.?et?al.,?A?Fluorogenic?1,3-Dipolar?Cycloaddition?Reaction?of?3-Azidocoumarins?and?Acetylenes.?Org.?Lett.,?2004,?6,?4603-4606.）所示的方法，采用二羥基苯甲醛、N-乙酰甘氨酸和疊氮化鈉制備3-疊氮-7-羥基香豆素；

（2）將5.0?μL?10?mg/mL的漆酶和5.0?μL?0.25?mM?3-疊氮-7-羥基香豆素分別加入至九種不同濃度且均為190?μL的尿素溶液中，九種尿素溶液的具體濃度分別為0.0?M、1.0?M、2.0?M、3.0?M、4.0?M、5.0?M、6.0?M、7.0?M、8.0?M，在4?^oC下培育1.0小時，混合后攪拌均勻，促使尿素對漆酶產生變性作用，引起漆酶構象變化；

（3）在步驟（2）反應結束后，采用紫外光譜儀在400~700?nm范圍內分別采集步驟（2）中九種反應后的尿素溶液的吸收光譜；

（4）根據九種尿素溶液的尿素濃度和紫外吸收強度，繪制漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。

在步驟（2）中，尿素溶液是由尿素溶解在乙酸緩沖液中配制而成，并將pH值調制為6.0。

3-疊氮-7-羥基香豆素的疊氮基團是一個給電子基團，導致該化合物的紫外吸收較弱。但是3-疊氮-7-羥基香豆素與漆酶相混合時，漆酶中與銅位點產生配位作用的組氨酸易于和疊氮基團中的氮原子通過氫鍵作用進行結合，形成疊氮香豆素--漆酶這種新型配合物，這就降低了3-疊氮-7-羥基香豆素中疊氮基團的給電子能力，疊氮香豆素--漆酶具有產生較強的紫外吸收能力。然而漆酶在尿素溶液中易產生變性作用，漆酶的三維結構遭到破壞，尿素以更強的結合力與組氨酸相結合，破壞疊氮香豆素--漆酶配合物的結構，使上述步驟（2）中含有3-疊氮-7-羥基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液中紫外吸收強度隨著變性強度的增加而逐漸減小，達到監測漆酶構象變化的目的。